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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 质粒酶切条带问题
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coffee159

金虫 (小有名气)

[求助] 质粒酶切条带问题 已有2人参与

质粒构建好之后没有做酶切鉴定，直接送去测序了，测序是正确的。可现在做双酶切时总是有些问题。如图：
1 marker 2 质粒 3BamH1单酶切 4Xhol单酶切 5 双酶切
BamH1酶切时大片段下面出现了两条带
xhol酶切时大片段上面还有一条条带，是没有切开的吗？
双酶切时也出现了大片段下面的两条带。不知道这个是什么。
还有因为目的片段才200bp，所以前几次做酶切时总是看不到，是因为太小了吗？

谢谢

质粒酶切条带问题
2014-07-27酶切.jpg
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1楼 2014-07-27 21:50:22
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-07-28 08:42:23
coffee159: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-07-28 09:30:50
DNA染色的亮度跟片段大小和分子数直接相关，由于你的片段很小，结合的燃料也很少，所以看上去不亮，从双酶切的结果来看，是可以看到一个小条带的，想看到更深的条带，可以加大酶切质粒的量

BamHI那个可能是非特异条带，说不清楚
XhoI上面一个，你的质粒那条泳道也有，可能是没有切开的开环质粒，总的来说，质粒的质量很好，没有问题
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2楼2014-07-27 22:09:04
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-07-28 08:42:27
coffee159: 金币+4, ★★★很有帮助, 谢谢，因为当时是用重叠PCR的方法，通过pcr载体把目的基因插入的，所以没办法pcr验证。还有，最近提的质粒，大小8000bp,酶切后总是在15000作用有一条带，我不清楚这个是什么原因。质粒不纯的话测序能测出来吗？ 2014-07-28 09:36:07
1.BamHI酶切应该是出现star活性了。你的基因才200bp，下面两条带肯定是切到载体上了，还有略微弥散，我记得这个酶稳定性不好。最好不要长时间切。
2.XhoI上面那个带和你的质粒对照应该是开环质粒无误。延长切割时间就消失掉了。
3.双酶切下面那两条带还是BamHI的star活性，至于你下面那个不亮很正常，因为首先你的基因不一定完全释放，可能一部分基因只是一端被切开，另一端还在载体上，就算你完全双酶切后基因和载体的摩尔比是1比1，但是你的载体远大于你的基因，嵌入的EB也远比你基因多。
4.酶切效果不好可以换PCR验证。
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3楼2014-07-27 23:14:27
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coffee159

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-07-27 22:09:04
DNA染色的亮度跟片段大小和分子数直接相关，由于你的片段很小，结合的燃料也很少，所以看上去不亮，从双酶切的结果来看，是可以看到一个小条带的，想看到更深的条带，可以加大酶切质粒的量

BamHI那个可能是非特异 ...

谢谢你。质粒的大小8000bp,如果没切开的话会是1000+吗？
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4楼2014-07-28 09:37:27
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-07-28 15:15:03
1.其实你如果测序都正确的话不需要再做双酶切验证了，而且你上面那个图下面那条带虽然弱，但是完全可以证明你的基因是在载体上，测序又正确那就没啥问题了。
2你提的质粒酶切后那条高的条带和你提出来的质粒的开环的那条带是否一致，我估计是开环的质粒
3.试剂盒提的质粒纯度都可以达到测序要求
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5楼2014-07-28 15:03:20
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coffee159

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-28 15:03:20
1.其实你如果测序都正确的话不需要再做双酶切验证了，而且你上面那个图下面那条带虽然弱，但是完全可以证明你的基因是在载体上，测序又正确那就没啥问题了。
2你提的质粒酶切后那条高的条带和你提出来的质粒的开环 ...

恩，谢谢你，今天又重新提的质粒酶切的，目的条带也出来了，只是在载体和目的条带之间有条弥散的带。
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6楼2014-07-28 15:10:49
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by coffee159 at 2014-07-28 15:10:49
恩，谢谢你，今天又重新提的质粒酶切的，目的条带也出来了，只是在载体和目的条带之间有条弥散的带。...

你上面那个图也有弥散，估计是你HamHI的问题，不影响你的验证
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7楼2014-07-28 15:27:32
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coffee159

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-28 15:27:32
你上面那个图也有弥散，估计是你HamHI的问题，不影响你的验证...

恩，非常感谢
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8楼2014-07-28 16:14:48
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