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博克侬浮码

银虫 (小有名气)

[求助] 克隆载体连接不上 已有1人参与

最近做克隆，目的片段1700bp,载体10.4k,分别单酶切后连接一直连接不上，不知道哪里出了问题，单酶切完全，就是胶回收率不高，用的QIAEXII试剂盒回收的载体，回收的浓度不高，才10ng/ul,  听说用醇浓缩可以提高浓度，不知道单酶切后可以直接醇浓缩载体吗，如果可以，具体步骤是什么，做了三个多月了，一直连接不上，请前辈们支支招。
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1楼 2014-07-22 18:12:18
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杨仔

铁虫 (初入文坛)
对，防载体自连是关键
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6楼2014-07-25 16:00:16
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
博克侬浮码(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:40:11
博克侬浮码: 金币+6, ★★★★★最佳答案 2014-07-25 22:13:22
1. 10ng/ul的确太少了，试着加大酶切载体量。单酶切回收没有必要用切胶回收，用一般的DNA回收试剂盒（洗脱柱）就没问题。也要考虑DNA洗脱柱的所能回收片段的最大值，确定你的载体大小没有超过上限

2.楼主说单酶切，是指你的目的片段和载体的两端都是同一位点对吧？比如片段是EcoRI-insert-EcoRI，然后载体单切后线性成EcoRI-vector-EcoRI。如果是这样的话，最好将你的载体做一下去磷酸化。用磷酸酶Alkaline Phosphatase处理一下（37° 1h），然后再回收。有些AP是可以直接在内切酶Buffer使用的，尤其是内切酶和AP是同一个公司的话。这样你就可以酶切后直接加AP，然后再回收，少一次损耗
注：只用AP处理你的载体，不要处理目的片段。粘性末端的连接是需要磷酸基的，用AP除去磷酸基团是为了防止你的质粒重新自连。如果不用AP处理，你加入连接酶后载体会重新自连，片段无法插入。但是如果你用AP把片段也处理的话，就没有磷酸基用了，所以只用处理质粒就行。

3. 注意目的片段和载体的数量比，一般是3:1-5:1.如果连接困难，可以试着加大目的片段量。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
2楼2014-07-22 19:01:34
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博克侬浮码

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-22 19:01:34
1. 10ng/ul的确太少了，试着加大酶切载体量。单酶切回收没有必要用切胶回收，用一般的DNA回收试剂盒（洗脱柱）就没问题。也要考虑DNA洗脱柱的所能回收片段的最大值，确定你的载体大小没有超过上限

2.楼主说单酶切 ...

我的载体是10.4K，用哪家公司的回收试剂盒好啊，之前老师给买的QIAEXII的，这个是要切胶的，每次回收的量都几乎没有，也不知道哪家公司回收效果好
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3楼2014-07-23 15:19:04
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usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 博克侬浮码 at 2014-07-23 15:19:04
我的载体是10.4K，用哪家公司的回收试剂盒好啊，之前老师给买的QIAEXII的，这个是要切胶的，每次回收的量都几乎没有，也不知道哪家公司回收效果好...

这个是Qiagen的试剂盒吧？我平时用的是他家的PCR purification kit和Gel purification kit。两者其实是一样的只是一个需要溶胶一个不用。不过你这个似乎载体比较大，PCR的那个好像10k以上就不行了，你可以试试QIAEX II Suspension，跟你的应该是一个系列的，只是不用切胶，直接溶液回收。我没用过不知道如何，但应该没有问题。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
4楼2014-07-24 21:58:46
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