| 查看: 2899 | 回复: 7 | |||
博克侬浮码银虫 (小有名气)
|
[求助]
克隆载体连接不上 已有1人参与
|
| 最近做克隆，目的片段1700bp,载体10.4k,分别单酶切后连接一直连接不上，不知道哪里出了问题，单酶切完全，就是胶回收率不高，用的QIAEXII试剂盒回收的载体，回收的浓度不高，才10ng/ul, 听说用醇浓缩可以提高浓度，不知道单酶切后可以直接醇浓缩载体吗，如果可以，具体步骤是什么，做了三个多月了，一直连接不上，请前辈们支支招。 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有186人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 连接克隆载体提取质粒结果跑出两条带
已经有11人回复
- 克隆的片段连不上T载体怎么回事？？？
已经有21人回复
- 目的片段与表达载体怎么都连接不上
已经有16人回复
- 求帮助！基因连接克隆载体后转化大肠杆菌，两天了都没长出菌。。。
已经有10人回复
- PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解?
已经有14人回复
- 表达载体的转化实验
已经有10人回复
- 关于pMD19-T载体连接转化问题
已经有7人回复
- 目的片段和载体连接一直不上
已经有24人回复
- 令我崩溃的TA克隆，老是连不上
已经有33人回复
- T载体连接不上去
已经有26人回复
- 克隆基因为什么一直连不到载体上
已经有11人回复
- T载体克隆做不出来，求帮助
已经有24人回复
- pMD18-T载体不需要酶切吗
已经有10人回复
- 目的基因连接到克隆载体后提取质粒测序，序列有问题
已经有11人回复
- 平末端连接做不出来克隆
已经有30人回复
- PMD19-T载体连接不上428bp的片段
已经有20人回复
- 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
已经有54人回复
- 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上
已经有26人回复
- 载体连接pcr片段一直连不上
已经有17人回复
- PCR产物与T载体连不上 求助
已经有29人回复
- 【求助/交流】克隆连接时间
已经有18人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
博克侬浮码(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:40:11
博克侬浮码: 金币+6, ★★★★★最佳答案 2014-07-25 22:13:22
感谢参与，应助指数 +1
博克侬浮码(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-22 20:40:11
博克侬浮码: 金币+6, ★★★★★最佳答案 2014-07-25 22:13:22
|
1. 10ng/ul的确太少了，试着加大酶切载体量。单酶切回收没有必要用切胶回收，用一般的DNA回收试剂盒（洗脱柱）就没问题。也要考虑DNA洗脱柱的所能回收片段的最大值，确定你的载体大小没有超过上限 2.楼主说单酶切，是指你的目的片段和载体的两端都是同一位点对吧？比如片段是EcoRI-insert-EcoRI，然后载体单切后线性成EcoRI-vector-EcoRI。如果是这样的话，最好将你的载体做一下去磷酸化。用磷酸酶Alkaline Phosphatase处理一下（37° 1h），然后再回收。有些AP是可以直接在内切酶Buffer使用的，尤其是内切酶和AP是同一个公司的话。这样你就可以酶切后直接加AP，然后再回收，少一次损耗 注：只用AP处理你的载体，不要处理目的片段。粘性末端的连接是需要磷酸基的，用AP除去磷酸基团是为了防止你的质粒重新自连。如果不用AP处理，你加入连接酶后载体会重新自连，片段无法插入。但是如果你用AP把片段也处理的话，就没有磷酸基用了，所以只用处理质粒就行。 3. 注意目的片段和载体的数量比，一般是3:1-5:1.如果连接困难，可以试着加大目的片段量。 |
2楼2014-07-22 19:01:34
博克侬浮码
银虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 318.5
- 散金: 406
- 帖子: 107
- 在线: 47.4小时
- 虫号: 2814101
- 注册: 2013-11-20
- 专业: 病原微生物变异与耐药
3楼2014-07-23 15:19:04
4楼2014-07-24 21:58:46
5楼2014-07-25 02:18:45
6楼2014-07-25 16:00:16
博克侬浮码
银虫 (小有名气)
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 318.5
- 散金: 406
- 帖子: 107
- 在线: 47.4小时
- 虫号: 2814101
- 注册: 2013-11-20
- 专业: 病原微生物变异与耐药
7楼2014-07-25 22:13:07
8楼2014-07-29 15:50:14
