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克隆载体连接不上 已有1人参与
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| 最近做克隆，目的片段1700bp,载体10.4k,分别单酶切后连接一直连接不上，不知道哪里出了问题，单酶切完全，就是胶回收率不高，用的QIAEXII试剂盒回收的载体，回收的浓度不高，才10ng/ul, 听说用醇浓缩可以提高浓度，不知道单酶切后可以直接醇浓缩载体吗，如果可以，具体步骤是什么，做了三个多月了，一直连接不上，请前辈们支支招。 |
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1. 10ng/ul的确太少了，试着加大酶切载体量。单酶切回收没有必要用切胶回收，用一般的DNA回收试剂盒（洗脱柱）就没问题。也要考虑DNA洗脱柱的所能回收片段的最大值，确定你的载体大小没有超过上限 2.楼主说单酶切，是指你的目的片段和载体的两端都是同一位点对吧？比如片段是EcoRI-insert-EcoRI，然后载体单切后线性成EcoRI-vector-EcoRI。如果是这样的话，最好将你的载体做一下去磷酸化。用磷酸酶Alkaline Phosphatase处理一下（37° 1h），然后再回收。有些AP是可以直接在内切酶Buffer使用的，尤其是内切酶和AP是同一个公司的话。这样你就可以酶切后直接加AP，然后再回收，少一次损耗 注：只用AP处理你的载体，不要处理目的片段。粘性末端的连接是需要磷酸基的，用AP除去磷酸基团是为了防止你的质粒重新自连。如果不用AP处理，你加入连接酶后载体会重新自连，片段无法插入。但是如果你用AP把片段也处理的话，就没有磷酸基用了，所以只用处理质粒就行。 3. 注意目的片段和载体的数量比，一般是3:1-5:1.如果连接困难，可以试着加大目的片段量。 |
2楼2014-07-22 19:01:34
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