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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 片段采取无缝克隆重组后，测序结果正确，但用IPTG诱导后，都未见目的蛋白表达
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laolaohutu

银虫 (正式写手)

[求助] 片段采取无缝克隆重组后，测序结果正确，但用IPTG诱导后，都未见目的蛋白表达 已有2人参与

片段采取无缝克隆重组后，测序结果正确，但用IPTG诱导后，都未见目的蛋白表达，向各位请教下可能存在的原因？？
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请享受无法回避的痛苦
1楼 2014-07-20 10:04:00
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-20 12:28:00
laolaohutu: 金币+5 2014-07-20 20:47:23
1、IPTG用的浓度是多少？诱导时间是多长？什么温度条件下？
2、n你的fusion protein有多大？
3、是否同时做对照？如GST的vector （假定你做的是GST fusion protein），对照有诱导否？。
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2楼2014-07-20 10:43:01
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是如何判定你的蛋白没有表达的，跑了PAGE和空载对照目标处没目的条带？你的这个蛋白有没有其他检测办法，比如活性检测之类的，你的菌体破碎充分不？诱导条件不合适？
LZ你还是贴一个你的sds-page的图吧，要不然问题太多。
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大家相互帮助哈
3楼2014-07-20 12:29:45
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laolaohutu

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-20 12:29:45
你是如何判定你的蛋白没有表达的，跑了PAGE和空载对照目标处没目的条带？你的这个蛋白有没有其他检测办法，比如活性检测之类的，你的菌体破碎充分不？诱导条件不合适？
LZ你还是贴一个你的sds-page的图吧，要不然问 ...

和未诱导的相比在预测的分子量附近未见特异性条带，原先诱导了一个，但是是采用酶切，都能表达可溶性蛋白，
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请享受无法回避的痛苦
4楼2014-07-20 20:47:15
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laolaohutu

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-20 10:43:01
1、IPTG用的浓度是多少？诱导时间是多长？什么温度条件下？
2、n你的fusion protein有多大？
3、是否同时做对照？如GST的vector （假定你做的是GST fusion protein），对照有诱导否？。

就是和对照相比，在预测的分子量附近未见特异性的条带
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请享受无法回避的痛苦
5楼2014-07-20 20:48:34
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younghe

铁虫 (小有名气)
你确定你的蛋白能够表达出来么，并不是每个基因插进去了，就能在E Coli中表达，或者说表达量非常低
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6楼2014-07-21 16:23:32
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laolaohutu

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by younghe at 2014-07-21 16:23:32
你确定你的蛋白能够表达出来么，并不是每个基因插进去了，就能在E Coli中表达，或者说表达量非常低

这样   你有遇到过类似的情况吗？如果换其他表达菌是否有可能表达出来？
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请享受无法回避的痛苦
7楼2014-07-22 10:21:53
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younghe

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by laolaohutu at 2014-07-22 10:21:53
这样   你有遇到过类似的情况吗？如果换其他表达菌是否有可能表达出来？...

换标签，或者换质粒，换菌效果不大
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8楼2014-07-22 10:34:31
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caitlin0626

新虫 (正式写手)
诱导条件不对？

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2014-07-22 21:39:48
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laolaohutu

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by caitlin0626 at 2014-07-22 21:39:48
诱导条件不对？

原先同一家族的基因在一样的诱导条件下都能诱导出来  现在是搞不清问题在哪  很是奇怪
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请享受无法回避的痛苦
10楼2014-07-23 18:40:15
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