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guduyiyu

金虫 (正式写手)

[求助] pET-28a与pGEX-4T-1表达蛋白的区别 已有4人参与

大神们,最近在做原核表达载体构建,以及表达条件的筛选,用到了两种载体,pET-28a与pGEX-4T-1,蛋白是胞内蛋白,这两种载体有什么区别吗,哪一个作为表达载体更好一些?
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xiaoamuchong

专家顾问 (职业作家)

科研工作者

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
dllchina: 金币+2 2014-04-24 21:26:57
类型和抗性不一样。pET-28a为组成型,抗kana,pGEX-4T-1为诱导型,抗Ampicillin。前者可以不经诱导组成型表达某个基因,后者在经过诱导物的诱导后才能表达某个基因;前者的优点就是不要诱导可以一直稳定的表达,这也决定了它的缺点,就是不能控制在何时表达某个基因,后者的优点就是可以控制表达的时间,但是需要诱导物。哪个更好的话,得看用途了。
曾经有人问我为什么要学微生物,我只是想离生命的本质更近一点。
2楼2014-04-24 19:51:04
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普通回帖

guduyiyu

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoamuchong at 2014-04-24 19:51:04
类型和抗性不一样。pET-28a为组成型,抗kana,pGEX-4T-1为诱导型,抗Ampicillin。前者可以不经诱导组成型表达某个基因,后者在经过诱导物的诱导后才能表达某个基因;前者的优点就是不要诱导可以一直稳定的表达,这也 ...

首先谢谢你啊,但是我现在用pET-28a作载体,导入宿主菌后,做外源表达时,也要经过IPTG的诱导啊,不诱导的话,蛋白表达水平特别的低,你所说的诱导是在表达外源蛋白时吗?还是别的什么
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3楼2014-04-27 16:37:33
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lihuahan

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by guduyiyu at 2014-04-27 16:37:33
首先谢谢你啊,但是我现在用pET-28a作载体,导入宿主菌后,做外源表达时,也要经过IPTG的诱导啊,不诱导的话,蛋白表达水平特别的低,你所说的诱导是在表达外源蛋白时吗?还是别的什么...

你好,我也在做原核表达载体构建,想请教一下我现在知道目的基因的CDS序列,设计引物的时候应该是根据ORF设计吗?还有就是pET-22,28,30,32这几个表达载体应该怎么选择尼?你们做的时候是手头有哪个用哪个嘛?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2014-05-01 11:02:48
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xavier1989

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

标签不同,GEX是用GST标签纯化,PET系列没记错是HIS。
我自己表达的情况来看,GST标签纯化的蛋白相对杂带少一点
5楼2014-05-01 12:27:19
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872940890

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

pgex表达后 获得可溶性蛋白的概率大一些
我知道我得继续努力!加油!
6楼2014-05-01 19:13:23
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guduyiyu

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lihuahan at 2014-05-01 11:02:48
你好,我也在做原核表达载体构建,想请教一下我现在知道目的基因的CDS序列,设计引物的时候应该是根据ORF设计吗?还有就是pET-22,28,30,32这几个表达载体应该怎么选择尼?你们做的时候是手头有哪个用哪个嘛?
...

不是吧,ORF不是开放式阅读框吗,这不是蛋白表达时才才用的东西吗,设计引物要在多克隆位点设计,目的片段要插入到多克隆位点啊,我在选择载体上没有绝对的标准啊,我现在用的就是PET-28,我是没有一个选择的依据吧,其实这个问题也困扰着我,同样也想请大神指点一下,共同进步
不努力永远不知道自己有多优秀
7楼2014-05-03 13:32:07
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lihuahan

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by guduyiyu at 2014-05-03 13:32:07
不是吧,ORF不是开放式阅读框吗,这不是蛋白表达时才才用的东西吗,设计引物要在多克隆位点设计,目的片段要插入到多克隆位点啊,我在选择载体上没有绝对的标准啊,我现在用的就是PET-28,我是没有一个选择的依据吧 ...

恩恩,1.因为我后期是要做蛋白纯化的,是不是就应该根据ORF设计引物尼?还是把CDS序列告诉公司,直接让他们设计并合成就可以?
2.还有一个问题就是双酶切位点应该怎么选择尼?除了尽量共用缓冲液,目的基因不能含有相同的酶切位点,还有别的跟目的蛋白有关的要求吗?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
8楼2014-05-03 18:36:44
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lihuahan

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by guduyiyu at 2014-05-03 13:32:07
不是吧,ORF不是开放式阅读框吗,这不是蛋白表达时才才用的东西吗,设计引物要在多克隆位点设计,目的片段要插入到多克隆位点啊,我在选择载体上没有绝对的标准啊,我现在用的就是PET-28,我是没有一个选择的依据吧 ...

关于第一个问题,现在有cDNA的第一链,想直接设计并合成两端带有酶切位点的引物,直接合成两端带有酶切位点的目的基因~

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
9楼2014-05-03 18:40:42
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781055707

木虫 (著名写手)

pGEX-4T-1,楼主有这个质粒吗?能送我一些吗?邮费我自己出就好了,谢谢。
采菊东篱下,悠然见南山。
10楼2015-03-16 16:38:56
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