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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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weido

新虫 (正式写手)


[交流] PET-28a 筛选及诱导问题

做了连接转化之后,就要筛选了,我知道PET-28a不用蓝白斑筛选,好像用IPTG诱导,那么筛选培养基(平板)用什么配制,请高手详细说明,谢谢!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


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weido: 金币+5 2013-01-25 13:22:24
IPTG诱导是做蛋白表达时用的,你首先是要筛选连接正确的克隆。pET-28a是卡那霉素抗性的吧,平板就是LB+kana。筛选时可以用菌落PCR先初步验证,挑选若干阳性克隆提取质粒做酶切鉴定。如果你是直接把目的基因克隆到表达载体里面的,则需要送酶切正确的克隆去测序。序列正确后就可以做表达了。
2楼2013-01-25 13:07:33
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weido

新虫 (正式写手)


引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-25 13:07:33
IPTG诱导是做蛋白表达时用的,你首先是要筛选连接正确的克隆。pET-28a是卡那霉素抗性的吧,平板就是LB+kana。筛选时可以用菌落PCR先初步验证,挑选若干阳性克隆提取质粒做酶切鉴定。如果你是直接把目的基因克隆到表 ...

非常感谢!
3楼2013-01-25 13:20:35
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lsxx

金虫 (小有名气)


★ ★ ★ ★ ★ ★
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weido: 金币+5 2013-01-25 16:49:03
我们实验室做PET28a筛选的培养基用LB固体培养基:100ml体系中,1g胰蛋白胨,0.5g酵母提取物,1gNaCl,1.5g琼脂糖。高压灭菌后,待培养基冷却至50°C左右,加100ul初浓度为100mg/ml的卡那霉素使之终浓度为100vg/ml,倒平板。加抗生素时温度不要过高,否则抗生素失活,达不到筛选目的。连接转化后,就是挑取单菌落,做pCR初鉴定,阳性的做双酶切鉴定,鉴定成功的送去测序,测序没错了就可以IPTG诱导表达了
4楼2013-01-25 15:57:57
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qqxs

木虫 (正式写手)


卡那抗性筛选呀
5楼2013-01-28 17:11:38
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jinweistu

新虫 (初入文坛)



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个人理解,蓝白斑筛选需要两个条件:
一是宿主菌即感受态为可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞
二是转化的载体要含编码有β-半乳糖苷酶N端部的分序列
这样才能完成α互补,实现β-半乳糖苷酶的完整表达,从而完成对X-gal的切割。
而pET载体大都不含LacZ基因序列,不能编码LacZ α肽,因此没有蓝白斑筛选功能。

个人愚见,还望各位多多指正!
7楼2017-10-25 17:36:35
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jinweistu

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
筛选用抗生素啊,PET-28a就是卡那霉素了,然后你用菌落PCR,酶切,测序鉴定正确的菌,才能扩大培养,然后诱导表达
8楼2017-10-25 17:42:19
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简单回复
2013-01-28 17:43   回复  
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