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weido

新虫 (正式写手)

[交流] PET-28a 筛选及诱导问题

做了连接转化之后，就要筛选了，我知道PET-28a不用蓝白斑筛选，好像用IPTG诱导，那么筛选培养基（平板）用什么配制，请高手详细说明，谢谢！
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1楼 2013-01-25 11:46:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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weido: 金币+5 2013-01-25 13:22:24
IPTG诱导是做蛋白表达时用的，你首先是要筛选连接正确的克隆。pET-28a是卡那霉素抗性的吧，平板就是LB+kana。筛选时可以用菌落PCR先初步验证，挑选若干阳性克隆提取质粒做酶切鉴定。如果你是直接把目的基因克隆到表达载体里面的，则需要送酶切正确的克隆去测序。序列正确后就可以做表达了。
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2楼2013-01-25 13:07:33
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weido

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-25 13:07:33
IPTG诱导是做蛋白表达时用的，你首先是要筛选连接正确的克隆。pET-28a是卡那霉素抗性的吧，平板就是LB+kana。筛选时可以用菌落PCR先初步验证，挑选若干阳性克隆提取质粒做酶切鉴定。如果你是直接把目的基因克隆到表 ...

非常感谢！
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3楼2013-01-25 13:20:35
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lsxx

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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weido: 金币+5 2013-01-25 16:49:03
我们实验室做PET28a筛选的培养基用LB固体培养基：100ml体系中，1g胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，1gNaCl，1.5g琼脂糖。高压灭菌后，待培养基冷却至50°C左右，加100ul初浓度为100mg/ml的卡那霉素使之终浓度为100vg/ml，倒平板。加抗生素时温度不要过高，否则抗生素失活，达不到筛选目的。连接转化后，就是挑取单菌落，做pCR初鉴定，阳性的做双酶切鉴定，鉴定成功的送去测序，测序没错了就可以IPTG诱导表达了
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4楼2013-01-25 15:57:57
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qqxs

木虫 (正式写手)
卡那抗性筛选呀
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5楼2013-01-28 17:11:38
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jinweistu

新虫 (初入文坛)
★
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个人理解，蓝白斑筛选需要两个条件：
一是宿主菌即感受态为可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞
二是转化的载体要含编码有β-半乳糖苷酶N端部的分序列
这样才能完成α互补，实现β-半乳糖苷酶的完整表达，从而完成对X-gal的切割。
而pET载体大都不含LacZ基因序列，不能编码LacZ α肽，因此没有蓝白斑筛选功能。

个人愚见，还望各位多多指正！
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7楼2017-10-25 17:36:35
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jinweistu

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
筛选用抗生素啊，PET-28a就是卡那霉素了，然后你用菌落PCR，酶切，测序鉴定正确的菌，才能扩大培养，然后诱导表达
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8楼2017-10-25 17:42:19
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zhaosenkuaku6楼
2013-01-28 17:43   回复  
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