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关于重组质粒 已有3人参与
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最近实验遇到了瓶颈，小女子希望能在此得到各位大侠的指点！ 我最近在做荧光定量RT-PCR方法的建立，需要以RNA为模版建立标准曲线。过程大致为：将扩增产物连接至pGEM-T载体上,构建pGEM-T/A2重组质粒,并进行测序鉴定。然后对重组质粒DNA进行体外转录,转录生成的RNA经过DNasel处理后作为定量用标准品。因为需要体外转录成RNA，所以重组质粒链接的片段需要是反向链接的才行，但是已经送6分重组质粒去测序了，全都是正向链接的！再这样测下去，什么时候是个头啊  ？请问各位高手，有木有什么办法改善一下这个情况呢？谢谢大家了~ |
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gyesang
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胡琴HuQin: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-22 15:51:09
| 不就你帖子里面的其他内容提出过多的疑问，单就片段连pGEM-T后的方向问题，如果你想获得另外一个方向的重组质粒，你得把扩增产物重新连接到pGEM-T上，据我的经验，理论上片段连T载体后，两个方向的概率各50%，而实际上在一次实验的连接体系里面，大部分方向是一致的（一个板子上长出的克隆发现基本一致，个人经验，所以你不用再在同一个板子上挑克隆测序了），要想获得另外一个方向的，必须再做一次独立的连接和转化，然后看看是不是另外一个方向的（这也需要一定的运气） |
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胡琴HuQin3楼2014-07-20 20:38:40
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