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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于重组质粒
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)

[求助] 关于重组质粒 已有3人参与

最近实验遇到了瓶颈，小女子希望能在此得到各位大侠的指点！  
    我最近在做荧光定量RT-PCR方法的建立，需要以RNA为模版建立标准曲线。过程大致为：将扩增产物连接至pGEM-T载体上,构建pGEM-T/A2重组质粒,并进行测序鉴定。然后对重组质粒DNA进行体外转录,转录生成的RNA经过DNasel处理后作为定量用标准品。因为需要体外转录成RNA，所以重组质粒链接的片段需要是反向链接的才行，但是已经送6分重组质粒去测序了，全都是正向链接的！再这样测下去，什么时候是个头啊？请问各位高手，有木有什么办法改善一下这个情况呢？谢谢大家了~
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1楼 2014-07-16 18:15:39
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

没动你在问什么呢？
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You can't depend on luck, so you had better focus on the others!
2楼2014-07-20 20:29:07
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-07-21 08:29:23
胡琴HuQin: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-22 15:51:09
不就你帖子里面的其他内容提出过多的疑问，单就片段连pGEM-T后的方向问题，如果你想获得另外一个方向的重组质粒，你得把扩增产物重新连接到pGEM-T上，据我的经验，理论上片段连T载体后，两个方向的概率各50%，而实际上在一次实验的连接体系里面，大部分方向是一致的（一个板子上长出的克隆发现基本一致，个人经验，所以你不用再在同一个板子上挑克隆测序了），要想获得另外一个方向的，必须再做一次独立的连接和转化，然后看看是不是另外一个方向的（这也需要一定的运气）
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

胡琴HuQin
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2014-07-20 20:38:40
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胡琴HuQin

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2014-07-20 20:38:40
不就你帖子里面的其他内容提出过多的疑问，单就片段连pGEM-T后的方向问题，如果你想获得另外一个方向的重组质粒，你得把扩增产物重新连接到pGEM-T上，据我的经验，理论上片段连T载体后，两个方向的概率各50%，而实际 ...

谢谢！我都挑了十多个菌测序，结果都是一样的！看来真的要像你说的方法来做做！
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4楼2014-07-22 15:50:41
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
4楼: Originally posted by 胡琴HuQin at 2014-07-22 15:50:41
谢谢！我都挑了十多个菌测序，结果都是一样的！看来真的要像你说的方法来做做！...

不客气！
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2014-07-22 16:31:31
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

直接加酶切位点不就决定了可以是反向连接吗？
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你的日子如何，你的力量也必如何！
6楼2014-07-22 21:20:59
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