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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 有cds序列和全基因组序列,如何设计引物来克隆和表达!
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well_想太多

新虫 (小有名气)

[求助] 有cds序列和全基因组序列,如何设计引物来克隆和表达!已有4人参与

我想对一个酶基因进行克隆和表达,现在知道这个酶基因的cds序列,以及这个菌的基因组序列,请问如果我想得到这个基因,在设计引物的时候应该怎么做?这方面我是菜鸟,本来就想用这个cds序列两端设计引物的,但是看大家有的说什么要找到保守序列,也有的说只用cds序列就行,只用cds的话以后会不会影响到表达呢?哎呀,我说的没有条理,见谅啊,大家放假了,实在心里很着急,还望高手给予指导!越详细越好!
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1楼2014-07-15 21:10:00
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ffzhb123

新虫 (初入文坛)
你好，我也是要对一个酶基因进行克隆，全基因测序已经完成，预测到了这个酶基因，对于设计引物这方面实在是不了解，希望可以交流一下
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17楼2016-03-14 09:51:53
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普通回帖

古木宁天

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-07-16 08:35:44
主要看你的菌株，如果你要用的菌上有启动子序列，就不需要考虑保守序列，
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懒
2楼2014-07-15 21:27:01
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 古木宁天 at 2014-07-15 21:27:01
主要看你的菌株，如果你要用的菌上有启动子序列，就不需要考虑保守序列，

怎么看启动子序列呢?是在cds序列上找还是在cds序列往前一段碱基上找呢?
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3楼2014-07-15 21:47:13
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-07-16 08:35:49
well_想太多: 金币+1, ★有帮助 2014-07-16 09:54:58
一般 启动子在起始密码子前找。cds区克隆先提rna逆转录，设计cds区引物来pcr然后粗略的测测序有个底，然后通过T载体连接到质粒上，最后导入目的菌里面表达，然后提出表达物来验证！大概思路是这样子的。欢迎交流，我也做cds区克隆

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4楼2014-07-16 01:49:44
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

你是想做真核还是原核呢？

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2014-07-16 01:51:34
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 未婚 at 2014-07-16 01:51:34
你是想做真核还是原核呢？

谢谢交流,我是打算做原核的.不明白为什么要提rna逆转录?我是想通过设计引物得到这个酶基因序列,然后直接进行克隆和表达,不知道我说的对不对
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6楼2014-07-16 09:54:27
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by well_想太多 at 2014-07-16 09:54:27
谢谢交流,我是打算做原核的.不明白为什么要提rna逆转录?我是想通过设计引物得到这个酶基因序列,然后直接进行克隆和表达,不知道我说的对不对...

不是做真核的就不用提RNA来做定量分析了。原核的直接克隆了是！我们做真核比较麻烦
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7楼2014-07-16 10:53:19
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 未婚 at 2014-07-16 10:53:19
不是做真核的就不用提RNA来做定量分析了。原核的直接克隆了是！我们做真核比较麻烦...

恩,那请问设计引物直接就在cds两端设计就行吗?还需要上下各找100bp吗,我发现我的cds序列中有三个orf,如果我就在cds的两端设计引物的话,那对后面克隆表达有影响吗
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8楼2014-07-16 14:05:20
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生
★
well_想太多(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-16 19:50:20
引用回帖:
8楼: Originally posted by well_想太多 at 2014-07-16 14:05:20
恩,那请问设计引物直接就在cds两端设计就行吗?还需要上下各找100bp吗,我发现我的cds序列中有三个orf,如果我就在cds的两端设计引物的话,那对后面克隆表达有影响吗...

要是拿去测序的话至少前后留50bp的测不准区域吧，只有先慢慢做出来测序了再看吧 祝你顺利！
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9楼2014-07-16 18:23:26
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 未婚 at 2014-07-16 18:23:26
要是拿去测序的话至少前后留50bp的测不准区域吧，只有先慢慢做出来测序了再看吧 祝你顺利！...

楼主，help,克隆的引物，从ATG开始发夹结构，往前走一段，大致走多少个合适引物20bp往前走了12bp是不是走的有点多，
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踏实
10楼2014-07-17 11:26:18
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