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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 有cds序列和全基因组序列,如何设计引物来克隆和表达!
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well_想太多

新虫 (小有名气)

[求助] 有cds序列和全基因组序列,如何设计引物来克隆和表达! 已有4人参与

我想对一个酶基因进行克隆和表达,现在知道这个酶基因的cds序列,以及这个菌的基因组序列,请问如果我想得到这个基因,在设计引物的时候应该怎么做?这方面我是菜鸟,本来就想用这个cds序列两端设计引物的,但是看大家有的说什么要找到保守序列,也有的说只用cds序列就行,只用cds的话以后会不会影响到表达呢?哎呀,我说的没有条理,见谅啊,大家放假了,实在心里很着急,还望高手给予指导!越详细越好!
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1楼 2014-07-15 21:10:00
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 古木宁天 at 2014-07-15 21:27:01
主要看你的菌株，如果你要用的菌上有启动子序列，就不需要考虑保守序列，

怎么看启动子序列呢?是在cds序列上找还是在cds序列往前一段碱基上找呢?
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3楼2014-07-15 21:47:13
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 未婚 at 2014-07-16 01:51:34
你是想做真核还是原核呢？

谢谢交流,我是打算做原核的.不明白为什么要提rna逆转录?我是想通过设计引物得到这个酶基因序列,然后直接进行克隆和表达,不知道我说的对不对
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6楼2014-07-16 09:54:27
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 未婚 at 2014-07-16 10:53:19
不是做真核的就不用提RNA来做定量分析了。原核的直接克隆了是！我们做真核比较麻烦...

恩,那请问设计引物直接就在cds两端设计就行吗?还需要上下各找100bp吗,我发现我的cds序列中有三个orf,如果我就在cds的两端设计引物的话,那对后面克隆表达有影响吗
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8楼2014-07-16 14:05:20
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by ouis歪歪 at 2014-07-17 12:17:31
先看酶基因和菌基因有不有相同的单一酶切位点，没有就要创建或者多扩一些序列看看

我现在往cds序列前后各找了100bp序列,然后设计引物,我把正引物光标放在第一个碱基的位置,下游引物光标放在最后碱基处,得到的引物分数很低,应该怎么修改呢?
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15楼2014-07-18 11:48:52
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well_想太多

新虫 (小有名气)
这是我前后各找100bp后设计的引物,没加上酶切位点呢,第二个图是ncbi blst之后的分析,不是很明白,请大家帮看看
有cds序列和全基因组序列,如何设计引物来克隆和表达!
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有cds序列和全基因组序列,如何设计引物来克隆和表达!-1
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16楼2014-07-18 17:13:04
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