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well_想太多

新虫 (小有名气)

[求助] 有cds序列和全基因组序列,如何设计引物来克隆和表达! 已有4人参与

我想对一个酶基因进行克隆和表达,现在知道这个酶基因的cds序列,以及这个菌的基因组序列,请问如果我想得到这个基因,在设计引物的时候应该怎么做?这方面我是菜鸟,本来就想用这个cds序列两端设计引物的,但是看大家有的说什么要找到保守序列,也有的说只用cds序列就行,只用cds的话以后会不会影响到表达呢?哎呀,我说的没有条理,见谅啊,大家放假了,实在心里很着急,还望高手给予指导!越详细越好!
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1楼 2014-07-15 21:10:00
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 未婚 at 2014-07-16 10:53:19
不是做真核的就不用提RNA来做定量分析了。原核的直接克隆了是！我们做真核比较麻烦...

恩,那请问设计引物直接就在cds两端设计就行吗?还需要上下各找100bp吗,我发现我的cds序列中有三个orf,如果我就在cds的两端设计引物的话,那对后面克隆表达有影响吗
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8楼2014-07-16 14:05:20
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古木宁天

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-07-16 08:35:44
主要看你的菌株，如果你要用的菌上有启动子序列，就不需要考虑保守序列，
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懒
2楼2014-07-15 21:27:01
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 古木宁天 at 2014-07-15 21:27:01
主要看你的菌株，如果你要用的菌上有启动子序列，就不需要考虑保守序列，

怎么看启动子序列呢?是在cds序列上找还是在cds序列往前一段碱基上找呢?
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3楼2014-07-15 21:47:13
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-07-16 08:35:49
well_想太多: 金币+1, ★有帮助 2014-07-16 09:54:58
一般 启动子在起始密码子前找。cds区克隆先提rna逆转录，设计cds区引物来pcr然后粗略的测测序有个底，然后通过T载体连接到质粒上，最后导入目的菌里面表达，然后提出表达物来验证！大概思路是这样子的。欢迎交流，我也做cds区克隆

[ 发自小木虫客户端 ]
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You can't depend on luck, so you had better focus on the others!
4楼2014-07-16 01:49:44
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查看全部 18 个回答
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