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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pgex 4t-1载体 无须诱导
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贝努努哈哈

铜虫 (小有名气)

[求助] pgex 4t-1载体 无须诱导 已有1人参与

1、我想从产朊假丝酵母菌中扩增出尿酸酶的基因 但是查genenbank中没有产朊假丝酵母菌来源的尿酸酶mRNA只有DNA 看一些文献设计的引物是按照DNA设计的 是不是在做PCR的过程中省去逆转录的步骤 直接扩增呢
2、设计引物时目的基因的5'端都是以ATG开头的 在目的基因的两端加入酶切位点是在设计好的引物基础上加4-6碱基作为酶切位点还是在5'端改几个碱基使之成为酶切位点？
3、两个目的基因连接 之间要加入一个酶切位点 我知道不能加目的基因、载体中存在的 但是不存在的酶切位点还有很多 我该怎么选择？
4、将PGEX 4T-1改造成无需诱导即可表达目的基因的载体 是删除其中的lacIq吗？如何删除？删除后如何将载体重新连接起来呢？
求大神指导
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1楼 2014-07-08 23:15:09
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gyesang

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kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-07-21 08:29:57
1. 这个基因很可能没有内含子，如果没有内含子完全可以从基因组中扩增获得

2. 基因特异引物设计好后，加酶切位点，而不是改动碱基使之成为酶切位点

3. 可以通过Overlap PCR将两个目的基因连接在一起

4. 也可以将pLac启动子后面的LacO序列删掉即可
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2楼2014-07-16 15:00:36
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贝努努哈哈

铜虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by gyesang at 2014-07-16 15:00:36
1. 这个基因很可能没有内含子，如果没有内含子完全可以从基因组中扩增获得

2. 基因特异引物设计好后，加酶切位点，而不是改动碱基使之成为酶切位点

3. 可以通过Overlap PCR将两个目的基因连接在一起

4. 也 ...

这个是不是有两个启动子 要都去掉吗
pgex 4t-1载体 无须诱导
201405080030351881.gif
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3楼2014-07-17 18:14:21
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gyesang

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3楼: Originally posted by 贝努努哈哈 at 2014-07-17 18:14:21
这个是不是有两个启动子 要都去掉吗

201405080030351881.gif
...

你说的是哪两个启动子，说的清楚一点哈
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4楼2014-07-18 15:17:04
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贝努努哈哈

铜虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by gyesang at 2014-07-18 15:17:04
你说的是哪两个启动子，说的清楚一点哈...

对不起 我看错了 如果删除laclq的话 怎么在整个序列中找到这段序列呢 有没有什么软件分析的 求指导
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5楼2014-07-19 10:00:20
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gyesang

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5楼: Originally posted by 贝努努哈哈 at 2014-07-19 10:00:20
对不起 我看错了 如果删除laclq的话 怎么在整个序列中找到这段序列呢 有没有什么软件分析的 求指导...

pGEX-4T-1图谱上有说明哪一段是编码LacI的序列的，然后设计引物扩增序列删除就可以了
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6楼2014-07-19 16:36:35
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-07-21 08:32:26
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5楼: Originally posted by 贝努努哈哈 at 2014-07-19 10:00:20
对不起 我看错了 如果删除laclq的话 怎么在整个序列中找到这段序列呢 有没有什么软件分析的 求指导...

先下载这个载体的序列和图谱，比如addgenel里面就有，见http://www.addgene.org/vector-database/2876/

pgex 4t-1载体 无须诱导-1

注释里面的ORF frame 3        3441        4400就是编码lacI的序列
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7楼2014-07-19 16:41:40
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贝努努哈哈

铜虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by gyesang at 2014-07-19 16:36:35
pGEX-4T-1图谱上有说明哪一段是编码LacI的序列的，然后设计引物扩增序列删除就可以了...

两边找到合适的内切酶删除吗 用DNA连接酶再连接起来吗？我想不通为什么要扩增LacI序列 应该是扩增除了LacI序列的载体才有用啊
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8楼2014-07-20 10:21:00
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-07-21 08:32:44
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8楼: Originally posted by 贝努努哈哈 at 2014-07-20 10:21:00
两边找到合适的内切酶删除吗 用DNA连接酶再连接起来吗？我想不通为什么要扩增LacI序列 应该是扩增除了LacI序列的载体才有用啊...

删除的方法有很多啊，具体的你可以去查如何做缺失突变体

我说的意思就是扩增除了LacI序列的载体
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9楼2014-07-20 20:29:05
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