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applexixixi

木虫 (小有名气)

[求助] IPTG诱导表达的问题

各位朋友，有谁做过大肠杆菌的IPTG诱导表达？我有一些问题想咨询一下。
1，是不是一定要把大肠培养到对数期再加IPTG诱导？具体OD值是多少有明确要求吗？
2，我的表达质粒是pUC18加了我的目的基因，不同质粒对IPTG诱导表达有什么影响吗？我看文献用pET系列的很多，这个区别大吗？
3，要表达不同的目的基因，诱导的具体条件是不是不同呢？都需要做哪些条件的优化？比如菌的OD值，IPTG浓度，诱导时间都需要做吗？
哪位朋友有现成的实验方案最好了，希望能分享一下。
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1楼 2012-12-10 21:11:52
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

karlgu18

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-12-11 20:12:57
applexixixi: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢你 2012-12-18 11:15:37
30个金币啊，可真真是不少的财物，见钱心喜了。
根据我多年IPTG诱导表达，主要是摇瓶的诱导表达经验(发酵罐我们不用IPTG了)来大致地阐述一下：
(1)质粒复制，蛋白诱导表达都是一个耗能的过程，会消耗宿主菌的ATP，因此增加了宿主菌的代谢负荷，抑制了宿主菌本身的生长繁殖。
(2)IPTG诱导表达其实没有严格OD600nm限定范围，不过很多人喜欢在对数初期(OD600nm=0.3-0.6)进行诱导，因为这个时候菌活力最高，诱导表达增加的负荷完全承受的住，并且菌体这个时候不会产生大量的副代谢产物，因此有利于产物表达和菌体繁殖。
(3)个人喜欢在对数后期或者平稳期(OD600nm=2-3)诱导表达。对数初期诱导表达菌量不高，IPTG浓度相对较高，增加的负荷较大，因此最终诱导完毕菌体量较低，大概2-3左右。对数后期诱导菌体量较高，IPTG浓度相对较低，减少了负荷，最终菌体量较高。最重要的是对数后期诱导有利于结构蛋白 折叠，形成正确的结构，原理可能是后期诱导菌体蛋白表达速率下降，菌体各种辅助蛋白折叠的产物较多，因而有利于获得可溶性蛋白。
(4)最后一点，不管是那个时期诱导，必然能获得你需要的蛋白。摇瓶体系中，大肠杆菌能完全承受IPTG诱导表达，无需多虑。
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3楼2012-12-11 14:31:10
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karlgu18

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by applexixixi at 2012-12-18 16:54:14
30度过夜培养是，早上一来就加上IPTG诱导4h？
还是仅仅指的是诱导阶段，温度是30度就诱导过夜，37度只需4h？
为何要30度呢，最适生长不是37度么？这是您们实验得出的结果是吗？
不好意思，这么多问号。。。
谢 ...

大肠杆菌诱导表达分成两个阶段：培养和诱导
(1) 培养
接种，30℃培养，待OD600nm=2-3，或者1-2时进行诱导。接种量千分之五。培养时间7-8h或者5-6h。
(2)诱导
30℃诱导，即下班前或者17点左右诱导。诱导是overnight。37℃菌体生长最快，各种酶活性最好，因此诱导时间短。但是37℃绝大部分都是包涵体，除非你做包涵体复兴。
(3)30℃培养是为了和诱导温度一致，降温太多对菌体活力有负面的影响，特别是温度降低5℃以下时。再加上你诱导产生的代谢负荷，因此不建议培养和诱导表达温度相差太大。
(4) 这些都是我们的经验和理论总结。
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8楼2012-12-18 17:09:16
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czdaeq

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-12-11 20:11:59
applexixixi: 金币+10, ★有帮助 2012-12-18 11:14:52
首先，IPTG浓度诱导一般可以在对数初期（OD,得需要你测生长曲线再定了）进行，这个时候菌体活性不错，扛得住；但是对于一些特殊要求的实验，比如表达的基因对于底物的利用很关键，那么需要一接种就诱导，要不然涨不起来的（但是这类一般就采用组成型，不用诱导型了）。
IPTG浓度，严格来说每种质粒（比如PUC18在MCS区插基因）都只需要探索一次即可（有的载体有的基因型最适表达量是不同滴）；
至于条件的摸索，一般先按文献试试，只有不如人意时，才摸索看看有没有改进，一般不是一上来就做这么多滴！
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2楼2012-12-11 10:09:15
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by karlgu18 at 2012-12-18 13:13:55
补充一下：这个IPTG浓度在0.1-1mM之间。我们一般用0.2mM。30℃，overnight。37℃，诱导4h。...

30度过夜培养是，早上一来就加上IPTG诱导4h？
还是仅仅指的是诱导阶段，温度是30度就诱导过夜，37度只需4h？
为何要30度呢，最适生长不是37度么？这是您们实验得出的结果是吗？
不好意思，这么多问号。。。
谢谢你啦
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7楼2012-12-18 16:54:14
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普通回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
applexixixi: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2012-12-18 11:15:54
pUC18可用于表达么？据说多克隆位点前没有启动子，如果自己的序列有启动子应该没太大问题吧？没试过，所以不敢说太满。
菌浓度一般在OD600=0.4~0.8之间，我比较喜欢用0.4-0.6
终浓度1mM，不行再优化，如果是过夜培养，降低IPTG浓度到0.5或0.25mM都没问题
诱导时间一般6~24h，一般就先12h试试，确定能翻译再做优化。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
4楼2012-12-11 15:13:58
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sxxuan

金虫 (著名写手)
刚看了一下，pUC既是克隆载体也可作表达载体，只要插入片段的方向与LacZ一致就可以
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你的日子如何，你的力量也必如何！
5楼2012-12-11 15:17:28
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karlgu18

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by karlgu18 at 2012-12-11 14:31:10
30个金币啊，可真真是不少的财物，见钱心喜了。
根据我多年IPTG诱导表达，主要是摇瓶的诱导表达经验(发酵罐我们不用IPTG了)来大致地阐述一下：
(1)质粒复制，蛋白诱导表达都是一个耗能的过程，会消耗宿主菌的ATP， ...

补充一下：这个IPTG浓度在0.1-1mM之间。我们一般用0.2mM。30℃，overnight。37℃，诱导4h。
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6楼2012-12-18 13:13:55
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applexixixi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by karlgu18 at 2012-12-18 17:09:16
大肠杆菌诱导表达分成两个阶段：培养和诱导
(1) 培养
接种，30℃培养，待OD600nm=2-3，或者1-2时进行诱导。接种量千分之五。培养时间7-8h或者5-6h。
(2)诱导
30℃诱导，即下班前或者17点左右诱导。诱导是overn ...

好的，非常感谢！
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9楼2012-12-18 18:57:56
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tete1987

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by karlgu18 at 2012-12-11 14:31:10
30个金币啊，可真真是不少的财物，见钱心喜了。
根据我多年IPTG诱导表达，主要是摇瓶的诱导表达经验(发酵罐我们不用IPTG了)来大致地阐述一下：
(1)质粒复制，蛋白诱导表达都是一个耗能的过程，会消耗宿主菌的ATP， ...

你好！请问发酵罐又什么代替IPTG诱导？
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嘿嘿，just for you~
10楼2013-03-07 21:26:49
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