应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » IPTG诱导表达的问题
51/1返回列表
查看: 11416  |  回复: 12
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

applexixixi

木虫 (小有名气)

[求助] IPTG诱导表达的问题

各位朋友，有谁做过大肠杆菌的IPTG诱导表达？我有一些问题想咨询一下。
1，是不是一定要把大肠培养到对数期再加IPTG诱导？具体OD值是多少有明确要求吗？
2，我的表达质粒是pUC18加了我的目的基因，不同质粒对IPTG诱导表达有什么影响吗？我看文献用pET系列的很多，这个区别大吗？
3，要表达不同的目的基因，诱导的具体条件是不是不同呢？都需要做哪些条件的优化？比如菌的OD值，IPTG浓度，诱导时间都需要做吗？
哪位朋友有现成的实验方案最好了，希望能分享一下。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达相关

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2012-12-10 21:11:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
applexixixi: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2012-12-18 11:15:54
pUC18可用于表达么？据说多克隆位点前没有启动子，如果自己的序列有启动子应该没太大问题吧？没试过，所以不敢说太满。
菌浓度一般在OD600=0.4~0.8之间，我比较喜欢用0.4-0.6
终浓度1mM，不行再优化，如果是过夜培养，降低IPTG浓度到0.5或0.25mM都没问题
诱导时间一般6~24h，一般就先12h试试，确定能翻译再做优化。
赞一下 回复此楼
你的日子如何，你的力量也必如何！
4楼2012-12-11 15:13:58
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

czdaeq

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-12-11 20:11:59
applexixixi: 金币+10, ★有帮助 2012-12-18 11:14:52
首先，IPTG浓度诱导一般可以在对数初期（OD,得需要你测生长曲线再定了）进行，这个时候菌体活性不错，扛得住；但是对于一些特殊要求的实验，比如表达的基因对于底物的利用很关键，那么需要一接种就诱导，要不然涨不起来的（但是这类一般就采用组成型，不用诱导型了）。
IPTG浓度，严格来说每种质粒（比如PUC18在MCS区插基因）都只需要探索一次即可（有的载体有的基因型最适表达量是不同滴）；
至于条件的摸索，一般先按文献试试，只有不如人意时，才摸索看看有没有改进，一般不是一上来就做这么多滴！
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2012-12-11 10:09:15
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

karlgu18

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-12-11 20:12:57
applexixixi: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢你 2012-12-18 11:15:37
30个金币啊，可真真是不少的财物，见钱心喜了。
根据我多年IPTG诱导表达，主要是摇瓶的诱导表达经验(发酵罐我们不用IPTG了)来大致地阐述一下：
(1)质粒复制，蛋白诱导表达都是一个耗能的过程，会消耗宿主菌的ATP，因此增加了宿主菌的代谢负荷，抑制了宿主菌本身的生长繁殖。
(2)IPTG诱导表达其实没有严格OD600nm限定范围，不过很多人喜欢在对数初期(OD600nm=0.3-0.6)进行诱导，因为这个时候菌活力最高，诱导表达增加的负荷完全承受的住，并且菌体这个时候不会产生大量的副代谢产物，因此有利于产物表达和菌体繁殖。
(3)个人喜欢在对数后期或者平稳期(OD600nm=2-3)诱导表达。对数初期诱导表达菌量不高，IPTG浓度相对较高，增加的负荷较大，因此最终诱导完毕菌体量较低，大概2-3左右。对数后期诱导菌体量较高，IPTG浓度相对较低，减少了负荷，最终菌体量较高。最重要的是对数后期诱导有利于结构蛋白 折叠，形成正确的结构，原理可能是后期诱导菌体蛋白表达速率下降，菌体各种辅助蛋白折叠的产物较多，因而有利于获得可溶性蛋白。
(4)最后一点，不管是那个时期诱导，必然能获得你需要的蛋白。摇瓶体系中，大肠杆菌能完全承受IPTG诱导表达，无需多虑。
赞一下(4人) 回复此楼
3楼2012-12-11 14:31:10
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
刚看了一下，pUC既是克隆载体也可作表达载体，只要插入片段的方向与LacZ一致就可以
赞一下 回复此楼
你的日子如何，你的力量也必如何！
5楼2012-12-11 15:17:28
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭