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寻香海棠

新虫 (初入文坛)

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专业: 微生物生理与生物化学

[求助] 关于菌落PCR，请教高手几个问题！已有4人参与

最开始做的时候用机器里之前师兄师姐设定的程序如下：
95℃ 3min
95℃  30s
55℃  30s
72℃  25s
72℃  10min
使用通用引物，两次都没成功，后来发现延伸时间太短，设为1min30s后，7个菌成功了4个，还有3个我按照修改后的方法来做仍然没有一个成功！这是什么回事呢？
然后我分析可能是预变性时间太短，没有将细胞壁裂解，打算设为10min，同时担心挑入培养基进入体系干扰实验，打算将液体培养的菌液离心取适量菌体。
请问大神这样做合不合适？还有什么可以改进的吗？

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人生得意需尽欢

1楼 2014-07-05 09:15:04

已阅关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

俗妮儿~

银虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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寻香海棠(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-06 17:47:26

就我做实验的结果来看，菌液比菌落难扩的多，菌液浓度比菌落要高很多，换句话说，就是你不好掌控PCR体系中模板的量。
   只要你的PCR体系合适，PCR体系中沾点琼脂完全不是问题。
   目前你扩不出16s，主要有两个原因，一是引物不合适，二是程序或体系不合适。
   虽然是通用引物，但并不一定合适你的菌。你可以自己尝试设计一下，或者去网上找找16s的通用引物，你会发现通用引物的序列并不是只有一种，建议你尝试一下其他的。
   有关PCR的体系和程序，要看你用哪一种酶。比如说takara的easytaq，你可以去网上找到它的说明书，说明书里就有PCR体系和程序，不要再沿用师兄师姐的程序和体系了，那不一定合适。一般变性这一步对于细菌菌落PCR来说不是很重要，延长到10min也不会有很好的效果。
   祝实验顺利！