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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌落PCR 之前能P出来，后来就重复不出来了
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR 之前能P出来，后来就重复不出来了 已有5人参与

前两天菌落刚长出来的时候做的PCR，感觉菌落比较小不晓得能不能P出来就试了试，结果能出现目的条带，然后等菌又张了两天后菌落变大后又做了两次重复，菌落是一样的，程序，酶都是一样的，可结果就是什么都么有，很郁闷，不知道什么原因，求助啊！！！真的想不通哪个环节出错了，菌落都是一样的，条件也都是一样的，到底是为什么呢？
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1楼 2014-04-29 09:13:00
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoxiaopang(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-29 18:19:12
菌落PCR假阳性很正常，质粒丢失也不是没有可能
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只有不断地失败才会成功
2楼2014-04-29 10:06:30
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windleakey

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知道什么原因，我都是把单菌落摇起来，做菌液pcr，其他的菌液也方便保存，这样不容易出错
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3楼2014-04-29 10:11:44
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zep616745243 at 2014-04-29 10:06:30
菌落PCR假阳性很正常，质粒丢失也不是没有可能

那是说我的菌都是假阳性？但是刚转化后挑的菌落做的PCR也是能P出来，只是引物特异性不太好，后来换的引物又P的，结果就出现这样子。我P的是基因组上的片段，跟质粒么有关系
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4楼2014-04-29 10:14:50
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zep616745243

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaoxiaopang at 2014-04-29 10:14:50
那是说我的菌都是假阳性？但是刚转化后挑的菌落做的PCR也是能P出来，只是引物特异性不太好，后来换的引物又P的，结果就出现这样子。我P的是基因组上的片段，跟质粒么有关系...

额，不好意思我以为你的是重组质粒菌，那就再试试你之前的引物呗，行的话就是引物的问题了
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只有不断地失败才会成功
5楼2014-04-29 10:22:03
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
其实菌P最好不要用你基因上的引物，最好使用你载体上的通用引物，这样正确率比较高。
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6楼2014-04-29 10:25:09
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
如果你PCR手法好的话，那么假阳性的概率很大
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
7楼2014-04-29 18:20:42
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你取的模板菌落的量是不是太大？菌落小的时候，通常不会有太大问题，菌落太大，容易取模板太多，影响还是会有一些的
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8楼2014-04-30 05:54:46
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天际雾影

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果第一次你P的结果是全都有的话，很有可能是假阳性。但做好的方法是把你有条带的菌落选两个摇菌，最后提质粒在验证一下。
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9楼2014-05-01 22:26:18
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99蜗牛99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaoxiaopang at 2014-04-29 10:14:50
那是说我的菌都是假阳性？但是刚转化后挑的菌落做的PCR也是能P出来，只是引物特异性不太好，后来换的引物又P的，结果就出现这样子。我P的是基因组上的片段，跟质粒么有关系...

我也是p基因组，之前能有条带，现在变小了，请问您的问题解决了吗，还请指点迷津呢。。
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10楼2015-10-21 09:11:01
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