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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于菌落PCR，请教高手几个问题！
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于菌落PCR，请教高手几个问题！ 已有4人参与

最开始做的时候用机器里之前师兄师姐设定的程序如下：
95℃   3min
95℃  30s
55℃  30s
72℃  25s
72℃  10min
使用通用引物，两次都没成功，后来发现延伸时间太短，设为1min30s后，7个菌成功了4个，还有3个我按照修改后的方法来做仍然没有一个成功！这是什么回事呢？
然后我分析可能是预变性时间太短，没有将细胞壁裂解，打算设为10min，同时担心挑入培养基进入体系干扰实验，打算将液体培养的菌液离心取适量菌体。
请问大神这样做合不合适？还有什么可以改进的吗？
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人生得意需尽欢
1楼 2014-07-05 09:15:04
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

考拉003

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-05 19:00:29
寻香海棠: 金币+1, ★有帮助 2014-07-07 16:41:44
我们实验室的经验是把菌挑一点加入EP管中加30微升无菌水煮沸10分钟，离心取上清加1微升PCR，效果非常好
赞一下(2人) 回复此楼
不是微生物专业的却进入微生物行业
5楼2014-07-05 12:13:36
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普通回帖

随风飘摇11

木虫 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2014-07-05 19:00:19
7个菌不一定全是阳性的啊，把那四个阳性的摇菌提质粒就好了

[ 发自小木虫客户端 ]
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天道酬勤
2楼2014-07-05 09:25:34
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-07-05 09:25:34
7个菌不一定全是阳性的啊，把那四个阳性的摇菌提质粒就好了

做的是16srdna，接着是去测物的，引物是通用引物，那我这样的话是不是把所有的菌都重新P一边最好
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人生得意需尽欢
3楼2014-07-05 09:51:59
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-07-05 09:25:34
7个菌不一定全是阳性的啊，把那四个阳性的摇菌提质粒就好了

测序，打错了，不好意思
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人生得意需尽欢
4楼2014-07-05 09:52:43
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 考拉003 at 2014-07-05 12:13:36
我们实验室的经验是把菌挑一点加入EP管中加30微升无菌水煮沸10分钟，离心取上清加1微升PCR，效果非常好

我今天就是离心取了一点菌体，预变性设为10min，如果还不行那就按你们那边的做法试试了！
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人生得意需尽欢
6楼2014-07-05 21:46:59
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俗妮儿~

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
寻香海棠(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-06 17:47:26
就我做实验的结果来看，菌液比菌落难扩的多，菌液浓度比菌落要高很多，换句话说，就是你不好掌控PCR体系中模板的量。
      只要你的PCR体系合适，PCR体系中沾点琼脂完全不是问题。
      目前你扩不出16s，主要有两个原因，一是引物不合适，二是程序或体系不合适。
      虽然是通用引物，但并不一定合适你的菌。你可以自己尝试设计一下，或者去网上找找16s的通用引物，你会发现通用引物的序列并不是只有一种，建议你尝试一下其他的。
      有关PCR的体系和程序，要看你用哪一种酶。比如说takara的easytaq，你可以去网上找到它的说明书，说明书里就有PCR体系和程序，不要再沿用师兄师姐的程序和体系了，那不一定合适。一般变性这一步对于细菌菌落PCR来说不是很重要，延长到10min也不会有很好的效果。
      祝实验顺利！
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7楼2014-07-05 21:48:09
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么你一定要求7个100%都能鉴定出来呢？
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8楼2014-07-06 10:47:06
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
寻香海棠(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-06 17:47:37
先挑到小管中培养，再PCR。挑克隆不太好控制。
PCR没有就是没有。
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9楼2014-07-06 13:17:05
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 俗妮儿~ at 2014-07-05 21:48:09
就我做实验的结果来看，菌液比菌落难扩的多，菌液浓度比菌落要高很多，换句话说，就是你不好掌控PCR体系中模板的量。
      只要你的PCR体系合适，PCR体系中沾点琼脂完全不是问题。
      目前你扩不出16s，主要有 ...

用的是takara的taq，我用了修改后的方法和程序后都弄出来了，已经拿去测序了，谢谢！
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人生得意需尽欢
10楼2014-07-07 16:39:16
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