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汕头大学海洋科学接受调剂
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于菌落PCR,请教高手几个问题! 已有4人参与

最开始做的时候用机器里之前师兄师姐设定的程序如下:
95℃   3min
95℃  30s
55℃  30s
72℃  25s
72℃  10min
使用通用引物,两次都没成功,后来发现延伸时间太短,设为1min30s后,7个菌成功了4个,还有3个我按照修改后的方法来做仍然没有一个成功!这是什么回事呢?
然后我分析可能是预变性时间太短,没有将细胞壁裂解,打算设为10min,同时担心挑入培养基进入体系干扰实验,打算将液体培养的菌液离心取适量菌体。
请问大神这样做合不合适?还有什么可以改进的吗?
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人生得意需尽欢
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 俗妮儿~ at 2014-07-05 21:48:09
就我做实验的结果来看,菌液比菌落难扩的多,菌液浓度比菌落要高很多,换句话说,就是你不好掌控PCR体系中模板的量。
      只要你的PCR体系合适,PCR体系中沾点琼脂完全不是问题。
      目前你扩不出16s,主要有 ...

用的是takara的taq,我用了修改后的方法和程序后都弄出来了,已经拿去测序了,谢谢!
人生得意需尽欢
10楼2014-07-07 16:39:16
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)


myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2014-07-05 19:00:19
7个菌不一定全是阳性的啊,把那四个阳性的摇菌提质粒就好了

[ 发自小木虫客户端 ]
天道酬勤
2楼2014-07-05 09:25:34
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-07-05 09:25:34
7个菌不一定全是阳性的啊,把那四个阳性的摇菌提质粒就好了

做的是16srdna,接着是去测物的,引物是通用引物,那我这样的话是不是把所有的菌都重新P一边最好
人生得意需尽欢
3楼2014-07-05 09:51:59
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-07-05 09:25:34
7个菌不一定全是阳性的啊,把那四个阳性的摇菌提质粒就好了

测序,打错了,不好意思
人生得意需尽欢
4楼2014-07-05 09:52:43
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