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寻香海棠

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[求助] 关于菌落PCR，请教高手几个问题！已有4人参与

最开始做的时候用机器里之前师兄师姐设定的程序如下：
95℃ 3min
95℃  30s
55℃  30s
72℃  25s
72℃  10min
使用通用引物，两次都没成功，后来发现延伸时间太短，设为1min30s后，7个菌成功了4个，还有3个我按照修改后的方法来做仍然没有一个成功！这是什么回事呢？
然后我分析可能是预变性时间太短，没有将细胞壁裂解，打算设为10min，同时担心挑入培养基进入体系干扰实验，打算将液体培养的菌液离心取适量菌体。
请问大神这样做合不合适？还有什么可以改进的吗？

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人生得意需尽欢

1楼 2014-07-05 09:15:04

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2楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-07-05 09:25:34
7个菌不一定全是阳性的啊，把那四个阳性的摇菌提质粒就好了

做的是16srdna，接着是去测物的，引物是通用引物，那我这样的话是不是把所有的菌都重新P一边最好

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人生得意需尽欢

3楼2014-07-05 09:51:59

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2楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-07-05 09:25:34
7个菌不一定全是阳性的啊，把那四个阳性的摇菌提质粒就好了

测序，打错了，不好意思

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人生得意需尽欢

4楼2014-07-05 09:52:43

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5楼: Originally posted by 考拉003 at 2014-07-05 12:13:36
我们实验室的经验是把菌挑一点加入EP管中加30微升无菌水煮沸10分钟，离心取上清加1微升PCR，效果非常好

我今天就是离心取了一点菌体，预变性设为10min，如果还不行那就按你们那边的做法试试了！

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6楼2014-07-05 21:46:59

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7楼: Originally posted by 俗妮儿~ at 2014-07-05 21:48:09
就我做实验的结果来看，菌液比菌落难扩的多，菌液浓度比菌落要高很多，换句话说，就是你不好掌控PCR体系中模板的量。
只要你的PCR体系合适，PCR体系中沾点琼脂完全不是问题。
目前你扩不出16s，主要有 ...

用的是takara的taq，我用了修改后的方法和程序后都弄出来了，已经拿去测序了，谢谢！

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人生得意需尽欢

10楼2014-07-07 16:39:16

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