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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于菌落PCR，请教高手几个问题！
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于菌落PCR，请教高手几个问题！ 已有4人参与

最开始做的时候用机器里之前师兄师姐设定的程序如下：
95℃   3min
95℃  30s
55℃  30s
72℃  25s
72℃  10min
使用通用引物，两次都没成功，后来发现延伸时间太短，设为1min30s后，7个菌成功了4个，还有3个我按照修改后的方法来做仍然没有一个成功！这是什么回事呢？
然后我分析可能是预变性时间太短，没有将细胞壁裂解，打算设为10min，同时担心挑入培养基进入体系干扰实验，打算将液体培养的菌液离心取适量菌体。
请问大神这样做合不合适？还有什么可以改进的吗？
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人生得意需尽欢
1楼 2014-07-05 09:15:04
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 考拉003 at 2014-07-05 12:13:36
我们实验室的经验是把菌挑一点加入EP管中加30微升无菌水煮沸10分钟，离心取上清加1微升PCR，效果非常好

这样就是麻烦点，我觉得很靠谱，我就是增加了预变性的时间，让细菌细胞壁完全裂解，几个都出来了，已经拿去测序了
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人生得意需尽欢
11楼2014-07-07 16:40:50
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2014-07-05 19:00:19
7个菌不一定全是阳性的啊，把那四个阳性的摇菌提质粒就好了

[ 发自小木虫客户端 ]
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天道酬勤
2楼2014-07-05 09:25:34
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-07-05 09:25:34
7个菌不一定全是阳性的啊，把那四个阳性的摇菌提质粒就好了

做的是16srdna，接着是去测物的，引物是通用引物，那我这样的话是不是把所有的菌都重新P一边最好
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人生得意需尽欢
3楼2014-07-05 09:51:59
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-07-05 09:25:34
7个菌不一定全是阳性的啊，把那四个阳性的摇菌提质粒就好了

测序，打错了，不好意思
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人生得意需尽欢
4楼2014-07-05 09:52:43
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