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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PBⅠ121质粒双酶切问题
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hhxittxs

新虫 (初入文坛)

[求助] PBⅠ121质粒双酶切问题 已有4人参与

本人做PBⅠ121质粒双酶切，内切酶为BamHⅠ和HindⅢ，切了24h，这是PBⅠ121双酶切凝胶电泳图，做了个重复，1,3是酶切前的   2,4分别是对应酶切后的。2,4下是有两条带的（红色圈圈里面），不仔细看看不出来。marker为2000，这能表示切开了吗？
本人新手，金币不多，各位大神乐善好施帮个忙嘞！

PBⅠ121质粒双酶切问题
1.jpg
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1楼 2014-07-04 21:38:41
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hhxittxs(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-05 18:16:06
为什么不用5000marker做标记呢？如果电泳图上显示的酶切后的两个片段之和大小与酶切之前的大小差不多一致，并且切下的短条带大小是目的带大小，差不多可以确定是正确的，进一步验证的话就送去测序吧。另外看你的电泳图中条带很清晰但是亮度不太大，如果质粒浓度可以的话就是电泳液需要换一下了，这样切下的条带可能会明显些
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2楼2014-07-05 08:02:04
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hhxittxs

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yzj926521 at 2014-07-05 08:02:04
为什么不用5000marker做标记呢？如果电泳图上显示的酶切后的两个片段之和大小与酶切之前的大小差不多一致，并且切下的短条带大小是目的带大小，差不多可以确定是正确的，进一步验证的话就送去测序吧。另外看你的电泳 ...

啊，大概能判断出，切下的短条带大小是目的带大小，但是为什么它浓度这么低呢？还有就是我把上面的大条带切胶回收了之后，发现浓度降低好多，怎么回事呢
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3楼2014-07-05 16:00:18
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by hhxittxs at 2014-07-05 16:00:18
啊，大概能判断出，切下的短条带大小是目的带大小，但是为什么它浓度这么低呢？还有就是我把上面的大条带切胶回收了之后，发现浓度降低好多，怎么回事呢...

内切酶的能力有限啦，酶切体系中加的内切酶量少，切下来的条带就相对少吧，如果只是验证目的带是否连进载体中的话，那你这样不是成功了吗
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4楼2014-07-06 07:38:35
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by hhxittxs at 2014-07-05 16:00:18
啊，大概能判断出，切下的短条带大小是目的带大小，但是为什么它浓度这么低呢？还有就是我把上面的大条带切胶回收了之后，发现浓度降低好多，怎么回事呢...

胶回收中最后洗脱DNA的过程中会有损失的，浓度本来就不高的回收后检查有的都不一定能在电泳图上看到条带。可以用紫外分光光度计测一下浓度定量一下
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5楼2014-07-06 07:41:32
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可帅儿

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-07 16:24:22
用一个大的MARKER不是看得更清楚点吗？比如用10k的。PBI121这个载体我们以前常用的，拷贝数很低，所以切的时候尽量要多切，最好不要用水补足了。PBI121有8k多，用BamHI/HindIII切下来大约600bp片段。看你电泳图掉的片段不明显，只能说是没切完全。酶切时间可以缩短，但要保证限制酶的量足够。这个载体本来就不太好切，只能说有些细节注意一下。
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
6楼2014-07-07 15:08:44
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-16 12:54:06
你那个不亮的片段之所以不亮，原因在于它占质粒的比例太小了。
如果你切1ug,质粒1Wbp,片段2Kbp，那么你的片段就有0.2ug。同理，你对比一下你的就可以了。
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7楼2014-07-07 15:35:37
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j6918936

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-07-16 12:54:25
切开了，因为121内切酶的切割效率不高，就会是这样的，我的双酶切结果也是如此，请教砖家得出让我放心的结果。
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8楼2014-07-07 16:51:11
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