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84146922

金虫 (小有名气)

[求助] RNA变性电泳PAGE,带有重影 已有1人参与

15%的变性 尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳,样品是总RNA,跑出来的电泳带有重影,使用的条件是1XTBE,60V,电泳5h,使用的marker为非变性的marker,跑不会看是正常的。但是怎么其他目的带也有重影呢?望各位虫指点。
同时也跑了15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,条件一样,很正常,带分得很开,样品没有问题。

变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳结果:

RNA变性电泳PAGE,带有重影
20140613-RNA-变性PAGE.jpg
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84146922

金虫 (小有名气)

添加样品进入孔道是,样品不能沉淀在泳道的低端,而非变性电泳却没有这种情况
添加样品时,已经冲洗加样孔了,这个什么原因,望虫友帮助,谢谢
2楼2014-07-01 20:44:42
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
84146922(myprayer代发): 金币+3, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-07-02 12:17:31
84146922: 金币+17, ★★★★★最佳答案 2014-07-02 19:37:10
初手干这个,这是最常见的问题
urea极易析出,不断的在从胶里面扩散出来,聚集在well里面,loading buffer的密度不如urea高,urea实在是太高了,所以urea-PAGE上样前,注意是刚刚上样前,要用注射器使命的吹孔,把尿素吹出来。同时上样速度要快,因为尿素还在析出,尤其是well两侧的析出,时间长了样品即便上进去是好好的,也会被抬升和压成锥形。
3楼2014-07-02 10:14:01
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84146922

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-07-02 10:14:01
初手干这个,这是最常见的问题
urea极易析出,不断的在从胶里面扩散出来,聚集在well里面,loading buffer的密度不如urea高,urea实在是太高了,所以urea-PAGE上样前,注意是刚刚上样前,要用注射器使命的吹孔,把 ...

换了甲酰胺缓冲液之后,好很多了,谢谢
4楼2014-07-02 19:37:47
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 84146922 at 2014-07-02 19:37:47
换了甲酰胺缓冲液之后,好很多了,谢谢...

这是何苦!没见过跑PAGE还用甲酰胺buffer的,没必要,TBE足以胜任,甲酰胺太毒,能少用少用。
5楼2014-07-02 20:44:56
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84146922

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-07-02 20:44:56
这是何苦!没见过跑PAGE还用甲酰胺buffer的,没必要,TBE足以胜任,甲酰胺太毒,能少用少用。...

嗯嗯,是使用的TBE,上样品是加了2X的甲酰胺缓冲液,如果使用普通买酶送的10Xloading,吹打进样孔后,带还是有少许锥形,而用了2X的甲酰胺缓冲液,样品就很平
请问,还是什么好办法吗?
另外,有变性电泳的RNA Marker推荐吗?小分子量的,20-30bp...
谢谢
6楼2014-07-03 12:08:46
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她小她

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 84146922 at 2014-07-03 12:08:46
嗯嗯,是使用的TBE,上样品是加了2X的甲酰胺缓冲液,如果使用普通买酶送的10Xloading,吹打进样孔后,带还是有少许锥形,而用了2X的甲酰胺缓冲液,样品就很平
请问,还是什么好办法吗?
另外,有变性电泳的RNA M ...

你好,看到你的贴。想请教一些问题。我想用变性聚丙烯酰胺来跑dna差异条带。为什么条带堆积在一起,连marker都分不开呢。

[ 发自小木虫客户端 ]
7楼2014-07-22 07:04:51
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84146922

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 她小她 at 2014-07-22 07:04:51
你好,看到你的贴。想请教一些问题。我想用变性聚丙烯酰胺来跑dna差异条带。为什么条带堆积在一起,连marker都分不开呢。
...

你好,请问使用多少电压呢?我是60V,6h。
使用额是2X的甲酰胺Loading Buffer
8楼2014-07-22 09:11:58
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她小她

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 84146922 at 2014-07-22 09:11:58
你好,请问使用多少电压呢?我是60V,6h。
使用额是2X的甲酰胺Loading Buffer...

1500。你的marker分开了吗

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-07-22 10:02:38
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84146922

金虫 (小有名气)

分开了,很好
10楼2014-07-23 18:54:51
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