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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » RNA变性电泳PAGE，带有重影
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84146922

金虫 (小有名气)

[求助] RNA变性电泳PAGE，带有重影 已有1人参与

15%的变性 尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，样品是总RNA，跑出来的电泳带有重影，使用的条件是1XTBE，60V，电泳5h，使用的marker为非变性的marker，跑不会看是正常的。但是怎么其他目的带也有重影呢？望各位虫指点。
同时也跑了15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，条件一样，很正常，带分得很开，样品没有问题。

变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：

RNA变性电泳PAGE，带有重影
20140613-RNA-变性PAGE.jpg
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1楼 2014-07-01 20:10:11
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84146922

金虫 (小有名气)
添加样品进入孔道是，样品不能沉淀在泳道的低端，而非变性电泳却没有这种情况
添加样品时，已经冲洗加样孔了，这个什么原因，望虫友帮助，谢谢
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2楼2014-07-01 20:44:42
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
84146922(myprayer代发): 金币+3, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-02 12:17:31
84146922: 金币+17, ★★★★★最佳答案 2014-07-02 19:37:10
初手干这个，这是最常见的问题
urea极易析出，不断的在从胶里面扩散出来，聚集在well里面，loading buffer的密度不如urea高，urea实在是太高了，所以urea-PAGE上样前，注意是刚刚上样前，要用注射器使命的吹孔，把尿素吹出来。同时上样速度要快，因为尿素还在析出，尤其是well两侧的析出，时间长了样品即便上进去是好好的，也会被抬升和压成锥形。
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3楼2014-07-02 10:14:01
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84146922

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-07-02 10:14:01
初手干这个，这是最常见的问题
urea极易析出，不断的在从胶里面扩散出来，聚集在well里面，loading buffer的密度不如urea高，urea实在是太高了，所以urea-PAGE上样前，注意是刚刚上样前，要用注射器使命的吹孔，把 ...

换了甲酰胺缓冲液之后，好很多了，谢谢
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4楼2014-07-02 19:37:47
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 84146922 at 2014-07-02 19:37:47
换了甲酰胺缓冲液之后，好很多了，谢谢...

这是何苦！没见过跑PAGE还用甲酰胺buffer的，没必要，TBE足以胜任，甲酰胺太毒，能少用少用。
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5楼2014-07-02 20:44:56
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84146922

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-07-02 20:44:56
这是何苦！没见过跑PAGE还用甲酰胺buffer的，没必要，TBE足以胜任，甲酰胺太毒，能少用少用。...

嗯嗯，是使用的TBE，上样品是加了2X的甲酰胺缓冲液，如果使用普通买酶送的10Xloading，吹打进样孔后，带还是有少许锥形，而用了2X的甲酰胺缓冲液，样品就很平
请问，还是什么好办法吗？
另外，有变性电泳的RNA Marker推荐吗？小分子量的，20-30bp...
谢谢
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6楼2014-07-03 12:08:46
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她小她

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 84146922 at 2014-07-03 12:08:46
嗯嗯，是使用的TBE，上样品是加了2X的甲酰胺缓冲液，如果使用普通买酶送的10Xloading，吹打进样孔后，带还是有少许锥形，而用了2X的甲酰胺缓冲液，样品就很平
请问，还是什么好办法吗？
另外，有变性电泳的RNA M ...

你好，看到你的贴。想请教一些问题。我想用变性聚丙烯酰胺来跑dna差异条带。为什么条带堆积在一起，连marker都分不开呢。

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7楼2014-07-22 07:04:51
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84146922

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 她小她 at 2014-07-22 07:04:51
你好，看到你的贴。想请教一些问题。我想用变性聚丙烯酰胺来跑dna差异条带。为什么条带堆积在一起，连marker都分不开呢。
...

你好，请问使用多少电压呢？我是60V，6h。
使用额是2X的甲酰胺Loading Buffer
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8楼2014-07-22 09:11:58
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她小她

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 84146922 at 2014-07-22 09:11:58
你好，请问使用多少电压呢？我是60V，6h。
使用额是2X的甲酰胺Loading Buffer...

1500。你的marker分开了吗

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9楼2014-07-22 10:02:38
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84146922

金虫 (小有名气)
分开了，很好
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10楼2014-07-23 18:54:51
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