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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】有意思的rna非变性凝胶电泳-之真相大白
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】有意思的rna非变性凝胶电泳-之真相大白 已有5人参与

用 qiagen mini ran easy 提的 用的标准提取过程中danase消化步骤
30度 15分钟

用的是非变性琼脂糖
分子标记 标准100bp dna marker
从上到下最亮的三条带分别是2000 1000 和 500
28s 上出现若干清晰度不同的条带，开始疑为dna没处理干净，但是经过Rna处理样品验证后，所有条带消失，说明这些可疑条带不是DNA，那么这个RNA非变性凝胶电泳检测RNA纯度时的判断就应该注意了，并不是28s 上方的有条带就是dna污染，不知道这个分析是否只适用于rnaeasy盒子提取。大家有没有遇到过相似的情况？

原来这条可以带真的不是dna
以下为验证试验及其结果


其中没有rna酶处理的样品出现严重降解是因为
相邻点样孔中的rna酶未作失活活脱酶处理，在跑胶过程中降解了相邻点样孔的Rna
原来动物的Rna非变性凝胶电泳并不是一成不变的3条带！差点迁怒与qiagen 呵呵
这件事告诉我们，有时候多钻点牛角尖是必要的

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-9-14 at 16:06 ]
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1楼 2010-09-13 20:11:14
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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看天(金币+2):鼓励回答 2010-09-13 20:19:16
用DNAase在处理一下吧，DNA条带没处理干净啊。不过你要是下一步做northern的话应该不影响，如果做反转录对实验结果可能有影响，而且5.8s RNA条带也不清楚。
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2楼2010-09-13 20:17:43
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 虫子火箭兵 at 2010-09-13 20:17:43:
用DNAase在处理一下吧，DNA条带没处理干净啊。不过你要是下一步做northern的话应该不影响，如果做反转录对实验结果可能有影响，而且5.8s RNA条带也不清楚。

碰巧我做的是rt pcr
还要做原核表达
怎么qiagen的盒子这么烂
还不如山寨版组合

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-9-13 at 21:49 ]
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3楼2010-09-13 20:51:55
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 虫子火箭兵 at 2010-09-13 20:17:43:
用DNAase在处理一下吧，DNA条带没处理干净啊。不过你要是下一步做northern的话应该不影响，如果做反转录对实验结果可能有影响，而且5.8s RNA条带也不清楚。

qiagen 的盒子在抽提中将5s降解了所以看不到5s这个正常。
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4楼2010-09-13 22:06:50
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
更有意思了，为了验证确实是dna污染，我用ran酶处理样品之后，所有条带消失？
这是否意味着28s上的条带也是rna，只不过因为复杂结构或其他原因造成的迁移率不同？
是否有人遇到过相同情况？
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5楼2010-09-14 11:07:08
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主这么纠结做什么？原因？
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6楼2010-09-14 11:09:01
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-09-14 11:09:01:
楼主这么纠结做什么？原因？

我原来一直很信任qiagen觉得王牌产品不可能这么烂把？所以跟它较劲

[ Last edited by yujiaping1 on 2010-9-14 at 14:24 ]
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7楼2010-09-14 11:25:07
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sfxt001

木虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-09-13 20:11:14:
用 qiagen mini ran easy 提的 用的标准提取过程中danase消化步骤
30度 15分钟

用的是非变性琼脂糖
分子标记 标准100bp dna marker
从上到下最亮的三条带分别是2000 1000 和 500
28s 上出现若干清晰度不同 ...

不仅动物RNA是这样，细菌RNA有时候也不是一成不变的3条带。
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8楼2010-09-15 00:35:18
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 虫子火箭兵 at 2010-09-13 20:17:43:
用DNAase在处理一下吧，DNA条带没处理干净啊。不过你要是下一步做northern的话应该不影响，如果做反转录对实验结果可能有影响，而且5.8s RNA条带也不清楚。

用invitrogen的吧，那个好，就是贵点
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9楼2010-09-15 20:46:44
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
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非变性胶跑成啥样都不奇怪

你变性条件下再跑一下看看呗
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10楼2010-09-15 20:53:43
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