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108391铜虫 (初入文坛)
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短RNA的变性聚丙烯酰胺电泳 已有1人参与
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近一个月都纠缠在这个问题上了，我表达了一个RNA外切酶，找公司合成底物测酶活。底物为互补双链，其中一条为20nt，另一条有20nt与之互补，但在3‘端多了10个A。酶是从3’端逐个逐个地切下核苷酸，产物为一系列酶切不完全的RNA，即在尿素-变性聚丙烯酰胺电泳上会出现多条带。 目前纠结在怎么观察结果上，试过银染，效果不好，好多次都是一片空白。请问跑过这种电泳的坛友们，有没有什么好的显示结果的方法呢？实验一次就要一天多时间，做不出结果心桑啊。 |
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 分子生物学技术 |
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108391(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-05-12 17:54:13
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RNA特异的切核酸酶？呵呵，要是我帮你想办法，你给点我用用？ 个人觉得，你这个方法测酶活，不地道， 不过你先要给点细节信息 你这个是ssRNA特异性的3‘-5’ exonuclease还是不区分ss和ds？ 还是说，你设计的这个底物，就是想看这段overhang的ss-polyA被切的情况？ 实际上，对这种活性的酶，酶单位或者活力的定义不是这样干的 有一些很方便的方法 比如你这个，如果是你这个底物，你用同位素标记这段ss-polyA 测两个常数，一个是底物的绝对质量，一个是底物的绝对放射性强度 然后加入你这个酶 反应之后，exonuclease会把ss-polyA切成AMP 这个时候利用TCA只能沉淀polynucleotide，而不能沉淀NTP之类的特性 把产物点在一个滤纸片上，这个时候的放射性强度，比如R1，质量，比如m1 然后用TCA洗这个滤纸片，洗个几次，free-NTP就丢掉了 再测放射性强度，比如R2 这个时候你可以算出剩余的产物m2 因为标记之后 R1/m1=R2/m2 就可以算出有多少质量变成AMP走掉了 相等于你可以得到，你这个酶，在这么个体系里面，产生了多少AMP 专业的说法： “1个活性单位是指，X oC、X min内催化释放X nmol酸性可溶性核苷酸所需要的酶量” |
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1083912楼2014-05-12 17:52:35
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-05-14 15:01:14
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条件艰苦不容易，再给你一个方案，但是这个不是什么nulease都可以试，需要nuclease活性比较强才行。 从oligonucleotides到nucleoside，也就是被nuclease切了，通过A260nm的光吸收，检测“增色效应”程度，也可以描述。 利用的是A260nm处消光系数有： 双链多聚核苷酸<单链多聚核苷酸<寡核苷酸<核苷酸<核苷<碱基的固有特性 也就是说，当你的底物，给了一个dsRNA-3‘-oligoA-overhang 被exo切，产生了NMP 这个时候A260会有所增加。 一般，商业化的RNaseA之类的，强悍有力的nuclease，就是用这种方式定义活性单位的： 比如 “1个活性单位是指，在37oC（pH5.0）条件下，水解酵母RNA溶液导致其260nm波长光吸收值增加1.0所需要的酶量”。 你可以一试，这个很简单的，仪器要求也不多，RNA完全不需要标记。 |
5楼2014-05-13 15:36:25
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