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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 短RNA的变性聚丙烯酰胺电泳
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108391

铜虫 (初入文坛)

[求助] 短RNA的变性聚丙烯酰胺电泳 已有1人参与

近一个月都纠缠在这个问题上了，我表达了一个RNA外切酶，找公司合成底物测酶活。底物为互补双链，其中一条为20nt，另一条有20nt与之互补，但在3‘端多了10个A。酶是从3’端逐个逐个地切下核苷酸，产物为一系列酶切不完全的RNA，即在尿素-变性聚丙烯酰胺电泳上会出现多条带。
目前纠结在怎么观察结果上，试过银染，效果不好，好多次都是一片空白。请问跑过这种电泳的坛友们，有没有什么好的显示结果的方法呢？实验一次就要一天多时间，做不出结果心桑啊。
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1楼 2014-05-12 15:41:09
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108391

铜虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-05-12 17:52:35
RNA特异的切核酸酶？呵呵，要是我帮你想办法，你给点我用用？
个人觉得，你这个方法测酶活，不地道，
不过你先要给点细节信息
你这个是ssRNA特异性的3‘-5’ exonuclease还是不区分ss和ds？
还是说，你设计的这 ...

开眼了，相当好的提议。我这个酶是从3‘端开始逐个切除核苷酸，底物要求是RNA单链或3’端有一段>7nt overhang的RNA双链，由于文献报道用本法证明此酶有3’-5‘核酸外切酶活性，只是它显示核酸的方法是用5‘ P32标记，我们这边没法做放射性的东西，所以就折腾在这个显示RNA的方法上面。原来也试过5’端荧光标记，我们这边的化学发光仪不行，直接点荧光标记的RNA上去都检测不到荧光。⊙﹏⊙b汗
如果有别的方法可以测，那也相当好呢。我只有18个金币，新虫，不过还是要送前辈一朵红花，如果有条件做的话我想前辈提供的方法更好，还可以定量。
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3楼2014-05-13 11:55:41
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
108391(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-05-12 17:54:13
RNA特异的切核酸酶？呵呵，要是我帮你想办法，你给点我用用？
个人觉得，你这个方法测酶活，不地道，
不过你先要给点细节信息
你这个是ssRNA特异性的3‘-5’ exonuclease还是不区分ss和ds？
还是说，你设计的这个底物，就是想看这段overhang的ss-polyA被切的情况？
实际上，对这种活性的酶，酶单位或者活力的定义不是这样干的
有一些很方便的方法
比如你这个，如果是你这个底物，你用同位素标记这段ss-polyA
测两个常数，一个是底物的绝对质量，一个是底物的绝对放射性强度
然后加入你这个酶
反应之后，exonuclease会把ss-polyA切成AMP
这个时候利用TCA只能沉淀polynucleotide，而不能沉淀NTP之类的特性
把产物点在一个滤纸片上，这个时候的放射性强度，比如R1，质量，比如m1
然后用TCA洗这个滤纸片，洗个几次，free-NTP就丢掉了
再测放射性强度，比如R2
这个时候你可以算出剩余的产物m2
因为标记之后
R1/m1=R2/m2
就可以算出有多少质量变成AMP走掉了
相等于你可以得到，你这个酶，在这么个体系里面，产生了多少AMP
专业的说法：
“1个活性单位是指，X oC、X min内催化释放X nmol酸性可溶性核苷酸所需要的酶量”
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108391
2楼2014-05-12 17:52:35
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-16 08:46:37
引用回帖:
3楼: Originally posted by 108391 at 2014-05-13 11:55:41
开眼了，相当好的提议。我这个酶是从3‘端开始逐个切除核苷酸，底物要求是RNA单链或3’端有一段>7nt overhang的RNA双链，由于文献报道用本法证明此酶有3’-5‘核酸外切酶活性，只是它显示核酸的方法是用5‘ P32 ...

我不太明白5`labeling如何检测3`-5` exonuclease活性?等你的酶从3'一直切到5'最后一个nt?这样得到的活性也意义不大。这跟你的底物长度和浓度有很大关系，并不能直接反应酶的催化能力。

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4楼2014-05-13 15:24:16
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-05-14 15:01:14
条件艰苦不容易，再给你一个方案，但是这个不是什么nulease都可以试，需要nuclease活性比较强才行。
从oligonucleotides到nucleoside，也就是被nuclease切了，通过A260nm的光吸收，检测“增色效应”程度，也可以描述。
利用的是A260nm处消光系数有：
双链多聚核苷酸<单链多聚核苷酸<寡核苷酸<核苷酸<核苷<碱基的固有特性
也就是说，当你的底物，给了一个dsRNA-3‘-oligoA-overhang
被exo切，产生了NMP
这个时候A260会有所增加。
一般，商业化的RNaseA之类的，强悍有力的nuclease，就是用这种方式定义活性单位的：
比如
“1个活性单位是指，在37oC（pH5.0）条件下，水解酵母RNA溶液导致其260nm波长光吸收值增加1.0所需要的酶量”。
你可以一试，这个很简单的，仪器要求也不多，RNA完全不需要标记。
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5楼2014-05-13 15:36:25
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