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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】变性聚丙烯酰胺电泳的marker怎么处理
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charster

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助】变性聚丙烯酰胺电泳的marker怎么处理

实验室只有takara的DL2000， 该对marker进行变性处理，还是可以直接加入？
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1楼 2011-04-11 23:19:57
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holyala

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
charster(金币+2):谢谢参与
看天(金币+5): 2011-04-13 09:12:13
呃...双链DNA在变性胶里面自己就会变性了，双链变单链~~你的样品是什么？如果是双链DNA的话，非变性PAGE会比较合适一点吧。我建议不要在变性胶里用双链DNA marker，不然就会：1.不准；2.分不清marker位置。具体的可以见下图。这是两次SDS-PAGE的结果拼起来的，从左往右第一条泳道是 50bp 双链DNA marker，第二泳道是RNA样品，第三泳道是100~1000nt 单链RNA marker，第四泳道是另一个RNA样品。可以明显看到第一泳道的marker由于DNA解链而变得模糊不清了，有的条带由一条变成了两条...


[ Last edited by holyala on 2011-4-12 at 09:43 ]
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2楼2011-04-12 09:38:18
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charster

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by holyala at 2011-04-12 09:38:18:
呃...双链DNA在变性胶里面自己就会变性了，双链变单链~~你的样品是什么？如果是双链DNA的话，非变性PAGE会比较合适一点吧。我建议不要在变性胶里用双链DNA marker，不然就会：1.不准；2.分不清marker位置。具体的 ...

我的样品是双链DNA，该跑变性还是非变性呢？ 以前没做过，只是两个DNA片段相差39bp, 琼脂糖分离效果不好，才想用聚丙烯酰胺凝胶的。其实也不清楚变性和非变性的区别。望指点，谢谢啦
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3楼2011-04-12 16:09:27
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holyala

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by charster at 2011-04-12 16:09:27:
我的样品是双链DNA，该跑变性还是非变性呢？ 以前没做过，只是两个DNA片段相差39bp, 琼脂糖分离效果不好，才想用聚丙烯酰胺凝胶的。其实也不清楚变性和非变性的区别。望指点，谢谢啦

嗯...你是要做回收呢，还是仅仅做个鉴定？另外，这两个DNA片段大小大概是多少？100bp、500bp还是1kb以上？
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4楼2011-04-12 16:46:22
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charster

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by holyala at 2011-04-12 16:46:22:
嗯...你是要做回收呢，还是仅仅做个鉴定？另外，这两个DNA片段大小大概是多少？100bp、500bp还是1kb以上？

要回收的，片段是200bp
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5楼2011-04-12 16:54:11
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holyala

木虫 (著名写手)
看天(EPI+1): 2011-04-13 09:11:58
引用回帖:
Originally posted by charster at 2011-04-12 16:54:11:
要回收的，片段是200bp

那可以用10%~12%的非变性PAGE胶来跑，需要做个预实验来确定电泳的电压和时间。根据我的经验，大概120V，30~45min左右，用较低电压和较长时间会得到更好的效果。
另外，其实也可以试试琼脂糖电泳，2%高分辨率琼脂糖凝胶，100V 1.5~2h左右，200bp左右的片段存在25bp以上的差异可以区分得非常明显。例如下图，L1是50bp ladder，L2是25bp ladder（即每个条带间的差异是50bp和25bp）。呃，不过做回收貌似有点难~~呵呵。



[ Last edited by holyala on 2011-4-12 at 17:13 ]
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6楼2011-04-12 17:07:13
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charster

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by holyala at 2011-04-12 17:07:13:
那可以用10%~12%的非变性PAGE胶来跑，需要做个预实验来确定电泳的电压和时间。根据我的经验，大概120V，30~45min左右，用较低电压和较长时间会得到更好的效果。
另外，其实也可以试试琼脂糖电泳，2%高分辨率 ...

双链DNA在变性的聚丙烯酰胺凝胶里跑出来是什么效果？
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7楼2011-04-12 21:55:51
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holyala

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3): 第一次看到如此详细且附图的应助，赞一个 2011-04-13 11:37:11
引用回帖:
Originally posted by charster at 2011-04-12 21:55:51:
双链DNA在变性的聚丙烯酰胺凝胶里跑出来是什么效果？

请见第一张图最左边的泳道。
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8楼2011-04-13 09:09:57
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她小她

银虫 (初入文坛)
★
charster(金币+2): 谢谢参与
变性聚丙烯酰胺电泳  请问，我在跑的时候marker 都没有跑开，为什么啊 ，电压么？？？真心 求助。
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9楼2014-07-21 22:49:19
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她小她

银虫 (初入文坛)
现在 都混乱了，请问，我做核酸的想要找差异条带，做变性聚丙烯酰胺电泳，当中怎么没有使用SDS，而且，出现了分不开的状况，堆积在大板子左上角，不随电泳时间改变。
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10楼2014-07-21 22:51:47
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