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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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charster

新虫 (小有名气)


[交流] 【求助】变性聚丙烯酰胺电泳的marker怎么处理

实验室只有takara的DL2000, 该对marker进行变性处理,还是可以直接加入?
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holyala

木虫 (著名写手)


★ ★ ★ ★ ★ ★
charster(金币+2):谢谢参与
看天(金币+5): 2011-04-13 09:12:13
呃...双链DNA在变性胶里面自己就会变性了,双链变单链~~你的样品是什么?如果是双链DNA的话,非变性PAGE会比较合适一点吧。我建议不要在变性胶里用双链DNA marker,不然就会:1.不准;2.分不清marker位置。具体的可以见下图。这是两次SDS-PAGE的结果拼起来的,从左往右第一条泳道是 50bp 双链DNA marker,第二泳道是RNA样品,第三泳道是100~1000nt 单链RNA marker,第四泳道是另一个RNA样品。可以明显看到第一泳道的marker由于DNA解链而变得模糊不清了,有的条带由一条变成了两条...


[ Last edited by holyala on 2011-4-12 at 09:43 ]
2楼2011-04-12 09:38:18
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charster

新虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by holyala at 2011-04-12 09:38:18:
呃...双链DNA在变性胶里面自己就会变性了,双链变单链~~你的样品是什么?如果是双链DNA的话,非变性PAGE会比较合适一点吧。我建议不要在变性胶里用双链DNA marker,不然就会:1.不准;2.分不清marker位置。具体的 ...

我的样品是双链DNA,该跑变性还是非变性呢? 以前没做过,只是两个DNA片段相差39bp, 琼脂糖分离效果不好,才想用聚丙烯酰胺凝胶的。其实也不清楚变性和非变性的区别。望指点,谢谢啦
3楼2011-04-12 16:09:27
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holyala

木虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by charster at 2011-04-12 16:09:27:
我的样品是双链DNA,该跑变性还是非变性呢? 以前没做过,只是两个DNA片段相差39bp, 琼脂糖分离效果不好,才想用聚丙烯酰胺凝胶的。其实也不清楚变性和非变性的区别。望指点,谢谢啦

嗯...你是要做回收呢,还是仅仅做个鉴定?另外,这两个DNA片段大小大概是多少?100bp、500bp还是1kb以上?
4楼2011-04-12 16:46:22
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charster

新虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by holyala at 2011-04-12 16:46:22:
嗯...你是要做回收呢,还是仅仅做个鉴定?另外,这两个DNA片段大小大概是多少?100bp、500bp还是1kb以上?

要回收的,片段是200bp
5楼2011-04-12 16:54:11
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holyala

木虫 (著名写手)


看天(EPI+1): 2011-04-13 09:11:58
引用回帖:
Originally posted by charster at 2011-04-12 16:54:11:
要回收的,片段是200bp

那可以用10%~12%的非变性PAGE胶来跑,需要做个预实验来确定电泳的电压和时间。根据我的经验,大概120V,30~45min左右,用较低电压和较长时间会得到更好的效果。
另外,其实也可以试试琼脂糖电泳,2%高分辨率琼脂糖凝胶,100V 1.5~2h左右,200bp左右的片段存在25bp以上的差异可以区分得非常明显。例如下图,L1是50bp ladder,L2是25bp ladder(即每个条带间的差异是50bp和25bp)。呃,不过做回收貌似有点难~~呵呵。



[ Last edited by holyala on 2011-4-12 at 17:13 ]
6楼2011-04-12 17:07:13
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charster

新虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by holyala at 2011-04-12 17:07:13:
那可以用10%~12%的非变性PAGE胶来跑,需要做个预实验来确定电泳的电压和时间。根据我的经验,大概120V,30~45min左右,用较低电压和较长时间会得到更好的效果。
另外,其实也可以试试琼脂糖电泳,2%高分辨率 ...

双链DNA在变性的聚丙烯酰胺凝胶里跑出来是什么效果?
7楼2011-04-12 21:55:51
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holyala

木虫 (著名写手)


★ ★ ★
reasonspare(金币+3): 第一次看到如此详细且附图的应助,赞一个 2011-04-13 11:37:11
引用回帖:
Originally posted by charster at 2011-04-12 21:55:51:
双链DNA在变性的聚丙烯酰胺凝胶里跑出来是什么效果?

请见第一张图最左边的泳道。
8楼2011-04-13 09:09:57
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她小她

银虫 (初入文坛)



charster(金币+2): 谢谢参与
变性聚丙烯酰胺电泳  请问,我在跑的时候marker 都没有跑开,为什么啊 ,电压么???真心 求助。
9楼2014-07-21 22:49:19
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她小她

银虫 (初入文坛)


现在 都混乱了,请问,我做核酸的想要找差异条带,做变性聚丙烯酰胺电泳,当中怎么没有使用SDS,而且,出现了分不开的状况,堆积在大板子左上角,不随电泳时间改变。
10楼2014-07-21 22:51:47
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