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charster

新虫 (小有名气)

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[交流] 【求助】变性聚丙烯酰胺电泳的marker怎么处理

实验室只有takara的DL2000，该对marker进行变性处理，还是可以直接加入？

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1楼 2011-04-11 23:19:57

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holyala

木虫 (著名写手)

看天(EPI+1): 2011-04-13 09:11:58

引用回帖:

Originally posted by charster at 2011-04-12 16:54:11:
要回收的，片段是200bp

那可以用10%~12%的非变性PAGE胶来跑，需要做个预实验来确定电泳的电压和时间。根据我的经验，大概120V，30~45min左右，用较低电压和较长时间会得到更好的效果。
另外，其实也可以试试琼脂糖电泳，2%高分辨率琼脂糖凝胶，100V 1.5~2h左右，200bp左右的片段存在25bp以上的差异可以区分得非常明显。例如下图，L1是50bp ladder，L2是25bp ladder（即每个条带间的差异是50bp和25bp）。呃，不过做回收貌似有点难~~呵呵。

[ Last edited by holyala on 2011-4-12 at 17:13 ]

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6楼2011-04-12 17:07:13

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holyala

木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★
charster(金币+2):谢谢参与
看天(金币+5): 2011-04-13 09:12:13

呃...双链DNA在变性胶里面自己就会变性了，双链变单链~~你的样品是什么？如果是双链DNA的话，非变性PAGE会比较合适一点吧。我建议不要在变性胶里用双链DNA marker，不然就会：1.不准；2.分不清marker位置。具体的可以见下图。这是两次SDS-PAGE的结果拼起来的，从左往右第一条泳道是 50bp 双链DNA marker，第二泳道是RNA样品，第三泳道是100~1000nt 单链RNA marker，第四泳道是另一个RNA样品。可以明显看到第一泳道的marker由于DNA解链而变得模糊不清了，有的条带由一条变成了两条...

[ Last edited by holyala on 2011-4-12 at 09:43 ]

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2楼2011-04-12 09:38:18

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charster

新虫 (小有名气)

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引用回帖:

Originally posted by holyala at 2011-04-12 09:38:18:
呃...双链DNA在变性胶里面自己就会变性了，双链变单链~~你的样品是什么？如果是双链DNA的话，非变性PAGE会比较合适一点吧。我建议不要在变性胶里用双链DNA marker，不然就会：1.不准；2.分不清marker位置。具体的 ...

我的样品是双链DNA，该跑变性还是非变性呢？以前没做过，只是两个DNA片段相差39bp, 琼脂糖分离效果不好，才想用聚丙烯酰胺凝胶的。其实也不清楚变性和非变性的区别。望指点，谢谢啦

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3楼2011-04-12 16:09:27

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