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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

[求助] 荧光定量PCR 扩增曲线求助 已有6人参与

诸位大侠我的试剂是使用SYBR.TAKARA的,机子是AB7300,但是做出来的扩增曲线不稳定啊。做的时候很多有时候做的还行,但是在有的时候扩增曲线出现在基线上面,有时候就是没有平台期,扩增曲线乱七八糟的。想问问这是什么原因呢?我从以下3方面入手解决。1.试剂 (开启后4°避光保存) 2。加样误差(已经很小心了) 3.仪器的稳定性(换了扩增的孔道)。事实上到现在都没查出来是什么原因。求教诸位大侠这究竟是怎么回事,问了其他实验室的师兄他们也不是很清楚。下面是我的图片。

荧光定量PCR 扩增曲线求助
IEF扩增曲线(58.5).jpg


荧光定量PCR 扩增曲线求助-1
IEF标准曲线.jpg


荧光定量PCR 扩增曲线求助-2
平行1溶解曲线.jpg


荧光定量PCR 扩增曲线求助-3
扩增曲线3号平行.jpg
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生命不息奋斗不止
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验! 2014-06-24 08:57:34
冷雁孤旅: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-06-24 10:28:20
之前我们也碰到过类似的情况,分析原因是由于buffer造成的线性扩增效应出了问题,换了buffer体系以后一下就OK了。换的时候是以降低扩增效率(速率)为策略的
人生贵在行动,迟疑不决时,不妨先迈出小小一步。
5楼2014-06-23 20:34:35
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普通回帖

冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

生命不息奋斗不止
2楼2014-06-22 16:29:14
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

版主在不在 @飞约疯人院 求分析
生命不息奋斗不止
3楼2014-06-23 20:00:07
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
冷雁孤旅: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-06-23 20:37:24
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-06-24 08:57:20
没有平台期:
1可能是模板,引物,镁离子,酶、dntps浓度有点高,建议优化下
2分析可能 模板太浓,稀释10倍100倍1000倍
3是否目的基因表达的水平较低,扩增起飞较晚还没达到平台期.
人生贵在行动,迟疑不决时,不妨先迈出小小一步。
4楼2014-06-23 20:32:22
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-06-23 20:32:22
没有平台期:
1可能是模板,引物,镁离子,酶、dntps浓度有点高,建议优化下
2分析可能 模板太浓,稀释10倍100倍1000倍
3是否目的基因表达的水平较低,扩增起飞较晚还没达到平台期.

谢谢版主
生命不息奋斗不止
6楼2014-06-23 20:39:37
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-06-23 20:34:35
之前我们也碰到过类似的情况,分析原因是由于buffer造成的线性扩增效应出了问题,换了buffer体系以后一下就OK了。换的时候是以降低扩增效率(速率)为策略的

我使用的额是SYBR I里面的 BUFFER早就加入进去了 这个不能换吧
生命不息奋斗不止
7楼2014-06-23 20:40:47
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

引用回帖:
7楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2014-06-23 20:40:47
我使用的额是SYBR I里面的 BUFFER早就加入进去了 这个不能换吧...

那这个还是别换了
人生贵在行动,迟疑不决时,不妨先迈出小小一步。
8楼2014-06-23 20:47:16
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-06-23 20:47:16
那这个还是别换了...

好吧  辛苦了
生命不息奋斗不止
9楼2014-06-24 00:48:16
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-06-24 08:57:46
冷雁孤旅: 金币+2, 有帮助 2014-06-24 20:12:35
你的引物问题吧,建议考察下你的引物。还有,目的片段是否跑胶,扩增产物是否就是目的片段?
10楼2014-06-24 07:56:17
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