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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR 扩增曲线求助
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beautybanana

木虫 (著名写手)
★
冷雁孤旅(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-20 21:21:13
引用回帖:
20楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2014-06-24 20:02:24
我做过普通PCR，从53度到60度做了一个梯度  胶片上没有发现二聚体以及非特异性扩增，然后在条带亮度相同的情况下选择了TM值最高的一个温度进行了QPCR。...

qPCR你用的SYBR法, 说明书上有标准的qPCR反应程序, 按照那个来就可以了, 一般是step1: 95℃ 30S; step2: 95℃ 5s; step3: 60℃ 30s.
40个repeats即可. 这个说明书上会有的. 你先把qPCR的扩增产物电泳检测下.
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21楼2014-06-24 23:49:03
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by beautybanana at 2014-06-24 23:49:03
qPCR你用的SYBR法, 说明书上有标准的qPCR反应程序, 按照那个来就可以了, 一般是step1: 95℃ 30S; step2: 95℃ 5s; step3: 60℃ 30s.
40个repeats即可. 这个说明书上会有的. 你先把qPCR的扩增产物电泳检测下....

好的  谢谢 师兄
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生命不息奋斗不止
22楼2014-06-25 00:51:51
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
冷雁孤旅: 金币+2, ★有帮助 2014-06-25 12:44:09
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-25 13:31:12
我们用的15UL体系中buffer加7.5ul,ROXII加0.3ul，其他成分的量适当调整，没看明白你这个是不是标准曲线，建议你对模板做倍比稀释看看选择最佳稀释倍数再做样品的定量
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23楼2014-06-25 10:21:22
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by yzj926521 at 2014-06-25 10:21:22
我们用的15UL体系中buffer加7.5ul,ROXII加0.3ul，其他成分的量适当调整，没看明白你这个是不是标准曲线，建议你对模板做倍比稀释看看选择最佳稀释倍数再做样品的定量

我是按照说明书上的来加的 我再稀释一下倍数摸索一下 3Q
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生命不息奋斗不止
24楼2014-06-25 12:44:10
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未婚

金虫 (正式写手)

分子小生

【答案】应助回帖

跑之前做过普通PCR摸索过引物条件么？
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You can't depend on luck, so you had better focus on the others!
25楼2014-07-20 21:10:17
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