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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

[求助] 荧光定量PCR 扩增曲线求助 已有6人参与

诸位大侠我的试剂是使用SYBR.TAKARA的,机子是AB7300,但是做出来的扩增曲线不稳定啊。做的时候很多有时候做的还行,但是在有的时候扩增曲线出现在基线上面,有时候就是没有平台期,扩增曲线乱七八糟的。想问问这是什么原因呢?我从以下3方面入手解决。1.试剂 (开启后4°避光保存) 2。加样误差(已经很小心了) 3.仪器的稳定性(换了扩增的孔道)。事实上到现在都没查出来是什么原因。求教诸位大侠这究竟是怎么回事,问了其他实验室的师兄他们也不是很清楚。下面是我的图片。

荧光定量PCR 扩增曲线求助
IEF扩增曲线(58.5).jpg


荧光定量PCR 扩增曲线求助-1
IEF标准曲线.jpg


荧光定量PCR 扩增曲线求助-2
平行1溶解曲线.jpg


荧光定量PCR 扩增曲线求助-3
扩增曲线3号平行.jpg
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生命不息奋斗不止
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

引用回帖:
16楼: Originally posted by beautybanana at 2014-06-24 19:07:59
这个和试剂及仪器的关系不是很大, 因为试剂和仪器都是很成熟的, 看熔解曲线的温度才70多℃, 可能是引物二聚体,你的目标片段应该没有被扩增出来, 如果是目标片段, 溶解曲线的温度应该在87℃左右. 你设计的片段有多大 ...

我做过普通PCR,从53度到60度做了一个梯度  胶片上没有发现二聚体以及非特异性扩增,然后在条带亮度相同的情况下选择了TM值最高的一个温度进行了QPCR。
生命不息奋斗不止
20楼2014-06-24 20:02:24
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

生命不息奋斗不止
2楼2014-06-22 16:29:14
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

版主在不在 @飞约疯人院 求分析
生命不息奋斗不止
3楼2014-06-23 20:00:07
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
冷雁孤旅: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-06-23 20:37:24
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-06-24 08:57:20
没有平台期:
1可能是模板,引物,镁离子,酶、dntps浓度有点高,建议优化下
2分析可能 模板太浓,稀释10倍100倍1000倍
3是否目的基因表达的水平较低,扩增起飞较晚还没达到平台期.
人生贵在行动,迟疑不决时,不妨先迈出小小一步。
4楼2014-06-23 20:32:22
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