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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

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专业: 环境微生物学

[求助] 荧光定量PCR 扩增曲线求助已有6人参与

诸位大侠我的试剂是使用SYBR.TAKARA的，机子是AB7300，但是做出来的扩增曲线不稳定啊。做的时候很多有时候做的还行，但是在有的时候扩增曲线出现在基线上面，有时候就是没有平台期，扩增曲线乱七八糟的。想问问这是什么原因呢？我从以下3方面入手解决。1.试剂（开启后4°避光保存） 2。加样误差（已经很小心了） 3.仪器的稳定性（换了扩增的孔道）。事实上到现在都没查出来是什么原因。求教诸位大侠这究竟是怎么回事，问了其他实验室的师兄他们也不是很清楚。下面是我的图片。

IEF扩增曲线（58.5）.jpg

IEF标准曲线.jpg

平行1溶解曲线.jpg

扩增曲线3号平行.jpg

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生命不息奋斗不止

1楼 2014-06-22 14:17:54

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beautybanana

木虫 (著名写手)

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专业: 纳米生物学

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
冷雁孤旅: 金币+4, ★★★★★最佳答案 2014-06-24 19:57:05
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-06-25 13:30:41

这个和试剂及仪器的关系不是很大, 因为试剂和仪器都是很成熟的, 看熔解曲线的温度才70多℃, 可能是引物二聚体,你的目标片段应该没有被扩增出来, 如果是目标片段, 溶解曲线的温度应该在87℃左右. 你设计的片段有多大, 在RT-PCR之前应该做个普通PCR确定你设计的片段可用. 通过操作的时候把加样板放在冰上, 把RT-PCR的成分(模版除外)混合好再分装到反应管中, 最后在加入模板, RT-PCR之前, 反应管(96/384孔板)短暂离心以混匀反应成分. 然后放入仪器PCR即可. 只要你设计的片段没问题, 一般不会有什么问题的. 我推测一下你这个实验的主要问题就在于没有目的片段, 你把片段设计在150-200 bp左右试试. 附上正确的熔解曲线图给你看看.