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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

[求助] 荧光定量PCR 扩增曲线求助 已有6人参与

诸位大侠我的试剂是使用SYBR.TAKARA的,机子是AB7300,但是做出来的扩增曲线不稳定啊。做的时候很多有时候做的还行,但是在有的时候扩增曲线出现在基线上面,有时候就是没有平台期,扩增曲线乱七八糟的。想问问这是什么原因呢?我从以下3方面入手解决。1.试剂 (开启后4°避光保存) 2。加样误差(已经很小心了) 3.仪器的稳定性(换了扩增的孔道)。事实上到现在都没查出来是什么原因。求教诸位大侠这究竟是怎么回事,问了其他实验室的师兄他们也不是很清楚。下面是我的图片。

荧光定量PCR 扩增曲线求助
IEF扩增曲线(58.5).jpg


荧光定量PCR 扩增曲线求助-1
IEF标准曲线.jpg


荧光定量PCR 扩增曲线求助-2
平行1溶解曲线.jpg


荧光定量PCR 扩增曲线求助-3
扩增曲线3号平行.jpg
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生命不息奋斗不止
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

引用回帖:
23楼: Originally posted by yzj926521 at 2014-06-25 10:21:22
我们用的15UL体系中buffer加7.5ul,ROXII加0.3ul,其他成分的量适当调整,没看明白你这个是不是标准曲线,建议你对模板做倍比稀释看看选择最佳稀释倍数再做样品的定量

我是按照说明书上的来加的 我再稀释一下倍数摸索一下 3Q
生命不息奋斗不止
24楼2014-06-25 12:44:10
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

生命不息奋斗不止
2楼2014-06-22 16:29:14
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)

版主在不在 @飞约疯人院 求分析
生命不息奋斗不止
3楼2014-06-23 20:00:07
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
冷雁孤旅: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-06-23 20:37:24
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-06-24 08:57:20
没有平台期:
1可能是模板,引物,镁离子,酶、dntps浓度有点高,建议优化下
2分析可能 模板太浓,稀释10倍100倍1000倍
3是否目的基因表达的水平较低,扩增起飞较晚还没达到平台期.
人生贵在行动,迟疑不决时,不妨先迈出小小一步。
4楼2014-06-23 20:32:22
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