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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR 扩增曲线求助
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 孙启亮 at 2014-06-24 07:56:17
你的引物问题吧，建议考察下你的引物。还有，目的片段是否跑胶，扩增产物是否就是目的片段？

引物跑了胶 溶解曲线是单峰 就是扩增曲线有时候可以 有时候很差 不明白原因 请问你们在加入SYBR I的时候是在避光操作么 还是在超净台上打开灯操作呢？我的SYBR I在光照下 曝光时间有一个小时吧。（因为每次加样都得一个多小时）
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生命不息奋斗不止
11楼2014-06-24 10:30:51
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vege的桌子

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用什么牌子的8联管，要不换一下管子吧
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12楼2014-06-24 11:57:20
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vege的桌子

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
冷雁孤旅(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-24 14:19:53
冷雁孤旅: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-06-24 15:23:11
引用回帖:
11楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2014-06-24 10:30:51
引物跑了胶 溶解曲线是单峰 就是扩增曲线有时候可以 有时候很差 不明白原因 请问你们在加入SYBR I的时候是在避光操作么 还是在超净台上打开灯操作呢？我的SYBR I在光照下 曝光时间有一个小时吧。（因为每次加样都得 ...

尽量在光线比较暗的环境下加吧，曝光时间有一个小时可能是有点久了，换一支新的吧，我以前用Takara的也没有出现这种情况
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13楼2014-06-24 12:00:06
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by vege的桌子 at 2014-06-24 11:57:20
用什么牌子的8联管，要不换一下管子吧

AXYGEN的
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生命不息奋斗不止
14楼2014-06-24 15:22:33
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by vege的桌子 at 2014-06-24 12:00:06
尽量在光线比较暗的环境下加吧，曝光时间有一个小时可能是有点久了，换一支新的吧，我以前用Takara的也没有出现这种情况...

好的  非常感谢
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生命不息奋斗不止
15楼2014-06-24 15:23:03
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
冷雁孤旅: 金币+4, ★★★★★最佳答案 2014-06-24 19:57:05
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-06-25 13:30:41
这个和试剂及仪器的关系不是很大, 因为试剂和仪器都是很成熟的, 看熔解曲线的温度才70多℃, 可能是引物二聚体,你的目标片段应该没有被扩增出来, 如果是目标片段, 溶解曲线的温度应该在87℃左右. 你设计的片段有多大, 在RT-PCR之前应该做个普通PCR确定你设计的片段可用. 通过操作的时候把加样板放在冰上, 把RT-PCR的成分(模版除外)混合好 再分装到反应管中, 最后在加入模板, RT-PCR之前, 反应管(96/384孔板)短暂离心以混匀反应成分. 然后放入仪器PCR即可. 只要你设计的片段没问题, 一般不会有什么问题的. 我推测一下你这个实验的主要问题就在于没有目的片段, 你把片段设计在150-200 bp左右试试. 附上正确的熔解曲线图给你看看.
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  • 附件 1 : standarddissociationcurve.jpg
    • 2014-06-24 19:07:49, 88.61 K
16楼2014-06-24 19:07:59
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beautybanana

木虫 (著名写手)
再附上较好的标准曲线扩增给你参考, (你把扩增图设置成对数图即可).
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  • 附件 1 : 标准曲线扩增及溶解曲线.TIF
    • 2014-06-24 19:15:02, 2.18 M
  • 附件 2 : 标准曲线.TIF
    • 2014-06-24 19:15:16, 205.14 K
17楼2014-06-24 19:15:23
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by beautybanana at 2014-06-24 19:07:59
这个和试剂及仪器的关系不是很大, 因为试剂和仪器都是很成熟的, 看熔解曲线的温度才70多℃, 可能是引物二聚体,你的目标片段应该没有被扩增出来, 如果是目标片段, 溶解曲线的温度应该在87℃左右. 你设计的片段有多大 ...

片段是设计的80-200BP之间的 我再把我的荧光产物电泳一下 看看条带结果
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生命不息奋斗不止
18楼2014-06-24 19:56:54
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by beautybanana at 2014-06-24 19:15:23
再附上较好的标准曲线扩增给你参考, (你把扩增图设置成对数图即可).

师兄 请问方便留下QQ号码么
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生命不息奋斗不止
19楼2014-06-24 19:59:15
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by beautybanana at 2014-06-24 19:07:59
这个和试剂及仪器的关系不是很大, 因为试剂和仪器都是很成熟的, 看熔解曲线的温度才70多℃, 可能是引物二聚体,你的目标片段应该没有被扩增出来, 如果是目标片段, 溶解曲线的温度应该在87℃左右. 你设计的片段有多大 ...

我做过普通PCR，从53度到60度做了一个梯度  胶片上没有发现二聚体以及非特异性扩增，然后在条带亮度相同的情况下选择了TM值最高的一个温度进行了QPCR。
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生命不息奋斗不止
20楼2014-06-24 20:02:24
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