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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 活性污泥中DNA模板的提取成功，但PCR扩增不出条带。
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nlhnq55

银虫 (小有名气)

[求助] 活性污泥中DNA模板的提取成功，但PCR扩增不出条带。已有3人参与

使用FastDNA® SPIN kit for Soil分别提取 “土壤” 和 “活性污泥” 中的细菌DNA模板，总DNA模板直接电泳检测，条带都非常亮。但是PCR扩增16S rRNA基因，只有土壤的模板正常出带 ，活性污泥的样品不出带 ，或者条带非常非常弱和弥散。

我看文章中，大家都使用这个试剂盒提取活性污泥中的DNA模板的，为什么我用就不行了呢？
不换了多个活性污泥样品，结果一样的。
PCR扩增其他的基因，也是上面一样的结果。

非常着急，困扰我的实验很久了，一直解决不了啊。
大家遇到过类似的情况吗 ？ 请帮我分析分析吧
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无穷般若心自在，语默动静体自然
1楼2014-06-20 20:38:12
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肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励应助 2014-06-21 14:28:34
nlhnq55: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-06-28 21:40:18
会不会是因为提取物中含有较多腐殖酸等抑制pcr的物质。
个人建议从2方面入手：
1，用dd水稀释你的基因组，减少pcr体系中基因组的加入量。
2，使用扩增复杂模板的酶，并且酶适量多加一些。
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2楼2014-06-20 23:35:37
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coolale

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
nlhnq55: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-06-28 21:41:57
发酵残余物和活性污泥的DNA提取好像和土壤不太一样，我自己也快要提了，不过还没试过。降低腐植酸好像是一点【秸秆沼气干发酵基质中微生物dna 提取方法筛选】，然后就是提取效率，就是能提出来的DNA占总量的多少（一般偏低）【Evaluation of several DNA extraction methods for obtaining total community DNA from anaerobic digestion sludge】。
文献没找到多少，我也还再研究
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3楼2014-06-27 23:17:36
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sea200k

金虫 (小有名气)
可以尝巢氏PCR
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4楼2014-08-22 21:13:31
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RuyangHan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

顶肥猫P的说法。你用的DNA量是多少ng? 建议试试1ng 或 0.1ng做PCR模板。还有你说有浅的条带，也可以取1uLPCR产物做模板重新PCR。
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5楼2014-08-22 22:55:18
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