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小冀-

版主 (著名写手)

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[求助] 与PMD-19T连接问题 已有6人参与

用PMD-19T载体与我的目的基因片段(3.3kb)链接,之前用高保真酶进行PCR扩增后通过加A试剂盒进行加A尾,之后热击转化,涂布后长出菌落,但是提质粒鉴定后发现载体自连(单双酶切条带一样,只有一条,有一个不一样的,但单切有出现两条条带);后来用一步克隆试剂盒进行连接,但涂布后没有菌落,一直不知道是什么原因,请高人指教···
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draco1987

木虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-06-18 10:24:48
我们实验室以前用的都是18t19t,可是后来怎么都不行了,实验做不出来,建议你用T-easy吧,很好很适用。

Takara的T载体Kit阶段性抽风已经不是一两年了,习惯了吧,下个批次就好了,毕竟还是相对便宜好用。
19楼2014-06-18 12:02:16
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普通回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小冀-: 金币+1 2014-06-17 10:51:49
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-06-17 15:08:09
平末端的再加A进行ta克隆,效率本来就很低,你可以考虑用taq,循环数低一点,多扩一点,回收时少加点水浓缩,连接时不加水多加PCR产物,试试,祝好

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-06-17 09:40:07
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小冀-

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引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 09:40:07
平末端的再加A进行ta克隆,效率本来就很低,你可以考虑用taq,循环数低一点,多扩一点,回收时少加点水浓缩,连接时不加水多加PCR产物,试试,祝好

我用Ex-Taq酶做过一次,片段是P出来了,而且都说用它P的都会存在A尾,所以就直接连了,鉴定时还是没有连上···
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3楼2014-06-17 10:51:12
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Neo2000

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小冀- at 2014-06-17 10:51:12
我用Ex-Taq酶做过一次,片段是P出来了,而且都说用它P的都会存在A尾,所以就直接连了,鉴定时还是没有连上···...

那说明问题出在ta克隆这一步,18t是很一般的t载体,建议用pGEM T Easy,NEB的连接酶

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-06-17 12:11:58
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小冀-

版主 (著名写手)

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引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 12:11:58
那说明问题出在ta克隆这一步,18t是很一般的t载体,建议用pGEM T Easy,NEB的连接酶
...

我也感觉是在这一步,但是又没法解释最后鉴定的时候载体居然都是自连的···
···
5楼2014-06-17 13:55:06
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Neo2000

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小冀- at 2014-06-17 13:55:06
我也感觉是在这一步,但是又没法解释最后鉴定的时候载体居然都是自连的···...

那个载体自连率是很高的,它不是都带有t的突出末端的。我都不买他们家的载体用,命中率不好

[ 发自小木虫客户端 ]
6楼2014-06-17 14:27:25
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古月木木

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小冀-: 金币+1 2014-07-25 09:36:43
小冀-: 金币+1, 有帮助 2014-10-23 21:50:23
建议做蓝白筛选,换ligase,直观提高连接效率
7楼2014-06-17 16:13:40
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小冀-: 金币+10, 有帮助, 我也是的,氨苄板直接筛的··· 2014-07-25 09:37:18
小冀-: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-10-23 21:50:35
引用回帖:
7楼: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-17 16:13:40
建议做蓝白筛选,换ligase,直观提高连接效率

连接效率上去了,不做蓝白斑也行,我都是直接上氨苄板筛的

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-06-17 17:59:44
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古月木木

新虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 17:59:44
连接效率上去了,不做蓝白斑也行,我都是直接上氨苄板筛的
...

可以降低假阳性的概率,lucky to you
9楼2014-06-18 08:00:05
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小冀-: 金币+5 2014-10-30 12:14:21
引用回帖:
9楼: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-18 08:00:05
可以降低假阳性的概率,lucky to you...

我这边的阳性率已经接近100%,你觉得还有必要蓝白斑吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
10楼2014-06-18 09:33:20
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