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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 与PMD-19T连接问题
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【悬赏金币】回答本帖问题，作者小冀-将赠送您 62 个金币

小冀-

版主 (著名写手)

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[求助] 与PMD-19T连接问题已有6人参与

用PMD-19T载体与我的目的基因片段（3.3kb）链接，之前用高保真酶进行PCR扩增后通过加A试剂盒进行加A尾，之后热击转化，涂布后长出菌落，但是提质粒鉴定后发现载体自连（单双酶切条带一样，只有一条，有一个不一样的，但单切有出现两条条带）；后来用一步克隆试剂盒进行连接，但涂布后没有菌落，一直不知道是什么原因，请高人指教···
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1楼2014-06-17 08:56:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

draco1987

木虫 (正式写手)
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17楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-06-18 10:24:48
我们实验室以前用的都是18t19t，可是后来怎么都不行了，实验做不出来，建议你用T-easy吧，很好很适用。

Takara的T载体Kit阶段性抽风已经不是一两年了，习惯了吧，下个批次就好了，毕竟还是相对便宜好用。
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19楼2014-06-18 12:02:16
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小冀-: 金币+1 2014-06-17 10:51:49
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-17 15:08:09
平末端的再加A进行ta克隆，效率本来就很低，你可以考虑用taq，循环数低一点，多扩一点，回收时少加点水浓缩，连接时不加水多加PCR产物，试试，祝好

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2楼2014-06-17 09:40:07
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小冀-

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引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 09:40:07
平末端的再加A进行ta克隆，效率本来就很低，你可以考虑用taq，循环数低一点，多扩一点，回收时少加点水浓缩，连接时不加水多加PCR产物，试试，祝好

我用Ex-Taq酶做过一次，片段是P出来了，而且都说用它P的都会存在A尾，所以就直接连了，鉴定时还是没有连上···
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3楼2014-06-17 10:51:12
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小冀- at 2014-06-17 10:51:12
我用Ex-Taq酶做过一次，片段是P出来了，而且都说用它P的都会存在A尾，所以就直接连了，鉴定时还是没有连上···...

那说明问题出在ta克隆这一步，18t是很一般的t载体，建议用pGEM T Easy，NEB的连接酶

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4楼2014-06-17 12:11:58
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小冀-

版主 (著名写手)

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引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 12:11:58
那说明问题出在ta克隆这一步，18t是很一般的t载体，建议用pGEM T Easy，NEB的连接酶
...

我也感觉是在这一步，但是又没法解释最后鉴定的时候载体居然都是自连的···
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5楼2014-06-17 13:55:06
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小冀- at 2014-06-17 13:55:06
我也感觉是在这一步，但是又没法解释最后鉴定的时候载体居然都是自连的···...

那个载体自连率是很高的，它不是都带有t的突出末端的。我都不买他们家的载体用，命中率不好

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6楼2014-06-17 14:27:25
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古月木木

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小冀-: 金币+1 2014-07-25 09:36:43
小冀-: 金币+1, ★有帮助 2014-10-23 21:50:23
建议做蓝白筛选，换ligase，直观提高连接效率
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7楼2014-06-17 16:13:40
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小冀-: 金币+10, ★有帮助, 我也是的，氨苄板直接筛的··· 2014-07-25 09:37:18
小冀-: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-10-23 21:50:35
引用回帖:
7楼: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-17 16:13:40
建议做蓝白筛选，换ligase，直观提高连接效率

连接效率上去了，不做蓝白斑也行，我都是直接上氨苄板筛的

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8楼2014-06-17 17:59:44
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古月木木

新虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 17:59:44
连接效率上去了，不做蓝白斑也行，我都是直接上氨苄板筛的
...

可以降低假阳性的概率，lucky to you
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9楼2014-06-18 08:00:05
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小冀-: 金币+5 2014-10-30 12:14:21
引用回帖:
9楼: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-18 08:00:05
可以降低假阳性的概率，lucky to you...

我这边的阳性率已经接近100%，你觉得还有必要蓝白斑吗？

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10楼2014-06-18 09:33:20
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