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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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小冀-

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[求助] 与PMD-19T连接问题 已有6人参与

用PMD-19T载体与我的目的基因片段(3.3kb)链接,之前用高保真酶进行PCR扩增后通过加A试剂盒进行加A尾,之后热击转化,涂布后长出菌落,但是提质粒鉴定后发现载体自连(单双酶切条带一样,只有一条,有一个不一样的,但单切有出现两条条带);后来用一步克隆试剂盒进行连接,但涂布后没有菌落,一直不知道是什么原因,请高人指教···
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小冀-

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引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 12:11:58
那说明问题出在ta克隆这一步,18t是很一般的t载体,建议用pGEM T Easy,NEB的连接酶
...

我也感觉是在这一步,但是又没法解释最后鉴定的时候载体居然都是自连的···
···
5楼2014-06-17 13:55:06
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Neo2000

木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小冀-: 金币+1 2014-06-17 10:51:49
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-06-17 15:08:09
平末端的再加A进行ta克隆,效率本来就很低,你可以考虑用taq,循环数低一点,多扩一点,回收时少加点水浓缩,连接时不加水多加PCR产物,试试,祝好

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-06-17 09:40:07
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小冀-

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引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 09:40:07
平末端的再加A进行ta克隆,效率本来就很低,你可以考虑用taq,循环数低一点,多扩一点,回收时少加点水浓缩,连接时不加水多加PCR产物,试试,祝好

我用Ex-Taq酶做过一次,片段是P出来了,而且都说用它P的都会存在A尾,所以就直接连了,鉴定时还是没有连上···
···
3楼2014-06-17 10:51:12
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Neo2000

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小冀- at 2014-06-17 10:51:12
我用Ex-Taq酶做过一次,片段是P出来了,而且都说用它P的都会存在A尾,所以就直接连了,鉴定时还是没有连上···...

那说明问题出在ta克隆这一步,18t是很一般的t载体,建议用pGEM T Easy,NEB的连接酶

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-06-17 12:11:58
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