应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 与PMD-19T连接问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 2711  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
【悬赏金币】回答本帖问题，作者小冀-将赠送您 62 个金币
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

[求助] 与PMD-19T连接问题 已有6人参与

用PMD-19T载体与我的目的基因片段（3.3kb）链接，之前用高保真酶进行PCR扩增后通过加A试剂盒进行加A尾，之后热击转化，涂布后长出菌落，但是提质粒鉴定后发现载体自连（单双酶切条带一样，只有一条，有一个不一样的，但单切有出现两条条带）；后来用一步克隆试剂盒进行连接，但涂布后没有菌落，一直不知道是什么原因，请高人指教···
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
···
1楼 2014-06-17 08:56:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小冀- at 2014-06-17 13:55:06
我也感觉是在这一步，但是又没法解释最后鉴定的时候载体居然都是自连的···...

那个载体自连率是很高的，它不是都带有t的突出末端的。我都不买他们家的载体用，命中率不好

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2014-06-17 14:27:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 23 个回答

Neo2000

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小冀-: 金币+1 2014-06-17 10:51:49
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-17 15:08:09
平末端的再加A进行ta克隆，效率本来就很低，你可以考虑用taq，循环数低一点，多扩一点，回收时少加点水浓缩，连接时不加水多加PCR产物，试试，祝好

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
2楼2014-06-17 09:40:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 09:40:07
平末端的再加A进行ta克隆，效率本来就很低，你可以考虑用taq，循环数低一点，多扩一点，回收时少加点水浓缩，连接时不加水多加PCR产物，试试，祝好

我用Ex-Taq酶做过一次，片段是P出来了，而且都说用它P的都会存在A尾，所以就直接连了，鉴定时还是没有连上···
赞一下 回复此楼
···
3楼2014-06-17 10:51:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小冀- at 2014-06-17 10:51:12
我用Ex-Taq酶做过一次，片段是P出来了，而且都说用它P的都会存在A尾，所以就直接连了，鉴定时还是没有连上···...

那说明问题出在ta克隆这一步，18t是很一般的t载体，建议用pGEM T Easy，NEB的连接酶

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2014-06-17 12:11:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 23 个回答
不应助 确定回帖应助 (注意：应助才可能被奖励，但不允许灌水，必须填写15个字符以上)
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿北京化工大学材料与化工（085600）296求调剂 +15 稻妻小编 2026-03-26 15/750 2026-03-29 15:39 by Serene1974
[考研] 一志愿南昌大学324求调剂 +4 hanamiko 2026-03-29 4/200 2026-03-29 15:23 by 唐沐儿
[基金申请] 面上5B能上会吗？ +3 redcom 2026-03-29 3/150 2026-03-29 12:03 by god_tian
[考研] 一志愿哈尔滨工业大学材料与化工方向336分 +9 辰沐5211314 2026-03-26 9/450 2026-03-29 01:12 by 我是小康
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +6 崔wj 2026-03-26 6/300 2026-03-29 01:11 by hanserlol
[考研] 11408软件工程求调剂 +3 Qiu学ing 2026-03-28 3/150 2026-03-28 21:50 by zhq0425
[考研] 283求调剂 +3 A child 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:41 by ms629
[考研] 070300求调剂306分 +4 26要上岸 2026-03-27 4/200 2026-03-28 13:06 by 唐沐儿
[考研] 266分，求材料冶金能源化工等调剂 +7 哇呼哼呼哼 2026-03-27 9/450 2026-03-28 12:22 by zllcz
[考研] 286求调剂 +12 PolarBear11 2026-03-26 12/600 2026-03-28 12:14 by zllcz
[考研] 291求调剂 +15 hhhhxn.. 2026-03-23 21/1050 2026-03-28 11:26 by self2008
[考研] 286求调剂 +4 丢掉懒惰 2026-03-27 7/350 2026-03-28 08:07 by baoball
[考研] 265求调剂 +8 小木虫085600 2026-03-27 8/400 2026-03-27 22:16 by 无际的草原
[考研] 一志愿南师大0703化学 275求调剂 +4 Ripcord上岸 2026-03-27 4/200 2026-03-27 17:00 by zhyzzh
[考研] 314求调剂 +3 溪云珂 2026-03-26 3/150 2026-03-27 11:20 by sanrepian
[考研] 调剂 +3 李嘉图·S·路 2026-03-27 3/150 2026-03-27 11:19 by wangjy2002
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +4 崔wj 2026-03-26 4/200 2026-03-27 08:04 by chemisry
[考研] 294分080500材料科学与工程求调剂 +4 柳溪边 2026-03-26 4/200 2026-03-26 21:14 by XPU李庆
[考研] 334分 一志愿武理-080500 材料求调剂 +4 李李不服输 2026-03-25 4/200 2026-03-25 21:26 by 星空星月
[考研] 285求调剂 +3 AZMK 2026-03-24 3/150 2026-03-25 12:23 by userper
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭