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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 关于连接转化的问题
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旭旭大将军

银虫 (小有名气)

[求助] 关于连接转化的问题 已有6人参与

最近在做连接转化，目的是测序，目的基因长度在2000bp左右,用的连接试剂盒是天根，蓝白斑筛选后做PCR还是没有条带，已经做了很多次了，最近两次转化的板子上居然蓝斑白斑均没有，是空白的          有两个问题：1、基因一直连不上的原因是什么      2、这两次板子上什么都没长的原因是什么

谢谢各位帮忙解答！
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1楼 2014-06-08 23:55:44
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
旭旭大将军(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-06-09 11:16:41
你要交代下你用的什么酶做PCR，连接体系之类的细节，我们才能帮到你

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2楼2014-06-09 00:13:04
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旭旭大将军

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-09 00:13:04
你要交代下你用的什么酶做PCR，连接体系之类的细节，我们才能帮到你

PCR用的是老师带回来的takara的PCRmix ，不清楚是否带A，明天查一下。   胶回收浓度是50    链接是   T ：1     DNA ： 4    水2   T4：1   buffer：1
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3楼2014-06-09 00:37:11
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 旭旭大将军 at 2014-06-09 00:37:11
PCR用的是老师带回来的takara的PCRmix ，不清楚是否带A，明天查一下。   胶回收浓度是50    链接是   T ：1     DNA ： 4    水2   T4：1   buffer：1...

检测的时候怎么做的？

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4楼2014-06-09 00:39:04
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hutil1543

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-06-09 11:16:47
首先做正对照证实你PCR没有问题，再做正对照证明你提质粒没有问题，再做正对照证明你连接没有问题。如果都没有问题，你就把AT克隆改成粘末端连接
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5楼2014-06-09 08:02:02
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古月木木

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
旭旭大将军(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-06-09 11:16:50
蓝白斑筛选至少会长出蓝色标记呀，2000bp不算长，楼主可以换个ligase，可以试一下toyobo的快速连接酶，30min就可以了
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6楼2014-06-09 11:03:35
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-09 11:03:35
蓝白斑筛选至少会长出蓝色标记呀，2000bp不算长，楼主可以换个ligase，可以试一下toyobo的快速连接酶，30min就可以了

所谓的快速连接只是噱头，我用的neb的酶也能做到快速连接，但我一般连过夜，效果会好些

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7楼2014-06-09 11:29:14
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古月木木

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-09 11:29:14
所谓的快速连接只是噱头，我用的neb的酶也能做到快速连接，但我一般连过夜，效果会好些
...

我们这边是做基因敲除的，上下游同源臂一般是2000左右，又不算长，30min足够了，干嘛要等过夜呢?又何必用快速连接呢？？多此一举
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8楼2014-06-09 12:20:55
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
检查下你的载体吧～～
一半链接做好载体很关键
验证一下载体是否做好
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修身、齐家、治国、平天下
9楼2014-06-09 12:35:51
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draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接买T载体的kit吧，又不贵。。。。。。
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10楼2014-06-09 14:21:18
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