应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 关于连接转化的问题
111/2返回列表12下一页
查看: 1711  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

旭旭大将军

银虫 (小有名气)

[求助] 关于连接转化的问题 已有6人参与

最近在做连接转化，目的是测序，目的基因长度在2000bp左右,用的连接试剂盒是天根，蓝白斑筛选后做PCR还是没有条带，已经做了很多次了，最近两次转化的板子上居然蓝斑白斑均没有，是空白的          有两个问题：1、基因一直连不上的原因是什么      2、这两次板子上什么都没长的原因是什么

谢谢各位帮忙解答！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-06-08 23:55:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
旭旭大将军(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-06-09 11:16:41
你要交代下你用的什么酶做PCR，连接体系之类的细节，我们才能帮到你

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
2楼2014-06-09 00:13:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

旭旭大将军

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-09 00:13:04
你要交代下你用的什么酶做PCR，连接体系之类的细节，我们才能帮到你

PCR用的是老师带回来的takara的PCRmix ，不清楚是否带A，明天查一下。   胶回收浓度是50    链接是   T ：1     DNA ： 4    水2   T4：1   buffer：1
赞一下 回复此楼
3楼2014-06-09 00:37:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 旭旭大将军 at 2014-06-09 00:37:11
PCR用的是老师带回来的takara的PCRmix ，不清楚是否带A，明天查一下。   胶回收浓度是50    链接是   T ：1     DNA ： 4    水2   T4：1   buffer：1...

检测的时候怎么做的？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2014-06-09 00:39:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hutil1543

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-06-09 11:16:47
首先做正对照证实你PCR没有问题，再做正对照证明你提质粒没有问题，再做正对照证明你连接没有问题。如果都没有问题，你就把AT克隆改成粘末端连接
赞一下 回复此楼
5楼2014-06-09 08:02:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

古月木木

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
旭旭大将军(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-06-09 11:16:50
蓝白斑筛选至少会长出蓝色标记呀，2000bp不算长，楼主可以换个ligase，可以试一下toyobo的快速连接酶，30min就可以了
赞一下 回复此楼
6楼2014-06-09 11:03:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 古月木木 at 2014-06-09 11:03:35
蓝白斑筛选至少会长出蓝色标记呀，2000bp不算长，楼主可以换个ligase，可以试一下toyobo的快速连接酶，30min就可以了

所谓的快速连接只是噱头，我用的neb的酶也能做到快速连接，但我一般连过夜，效果会好些

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
7楼2014-06-09 11:29:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

古月木木

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-09 11:29:14
所谓的快速连接只是噱头，我用的neb的酶也能做到快速连接，但我一般连过夜，效果会好些
...

我们这边是做基因敲除的，上下游同源臂一般是2000左右，又不算长，30min足够了，干嘛要等过夜呢?又何必用快速连接呢？？多此一举
赞一下 回复此楼
8楼2014-06-09 12:20:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
检查下你的载体吧～～
一半链接做好载体很关键
验证一下载体是否做好
赞一下 回复此楼
修身、齐家、治国、平天下
9楼2014-06-09 12:35:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接买T载体的kit吧，又不贵。。。。。。
赞一下 回复此楼
10楼2014-06-09 14:21:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 旭旭大将军 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 河北省自然科学基金 +5 Peterchao 2026-05-18 8/400 2026-05-24 11:58 by 晓晓爱翠翠
[基金申请] 西安交大新媒学院副院长用撤稿论文结题 +3 bjvtcliu 2026-05-24 5/250 2026-05-24 10:16 by kudofaye
[教师之家] 论文撤稿了 +3 bjvtcliu 2026-05-24 5/250 2026-05-24 10:06 by Equinoxhua
[考博] 26/27申博自荐 10+4 ZXW0202 2026-05-22 9/450 2026-05-24 08:47 by bjvtcliu
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 hvkbtfonbv 2026-05-23 3/150 2026-05-24 08:01 by 9ps9vgkqva
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 pmo95bazuy 2026-05-23 7/350 2026-05-24 06:35 by fpo5ljpv91
[基金申请] 揭秘青基评审内幕：几个A才能顺利中标 +3 国自然国社科中 2026-05-23 4/200 2026-05-23 15:37 by 2000zf36392
[基金申请] 青B发送上会通知了吗 +5 chemBioBro 2026-05-22 7/350 2026-05-23 12:35 by zhuifengzhy
[考博] 博士申请 +3 焦晓明 2026-05-21 3/150 2026-05-23 11:26 by mlc840311
[论文投稿] 投稿求助，期刊 +4 希冀，有书读 2026-05-20 8/400 2026-05-22 10:16 by 希冀，有书读
[文学芳草园] 献血感触 +7 呀呀好傻 2026-05-19 13/650 2026-05-21 20:15 by 呀呀好傻
[基金申请] 面上本子正文33页，违规吗？会被低分嘛？ +14 1234567wang 2026-05-17 16/800 2026-05-21 17:58 by 脆脆的饼干
[基金申请] 国自然评分 +4 无名者登山 2026-05-20 5/250 2026-05-21 16:35 by swuq
[基金申请] 国自然上会要求 +7 无名者登山 2026-05-18 11/550 2026-05-21 15:50 by draco1987
[基金申请] 提交了我也来说说感想 +9 fummck 2026-05-20 10/500 2026-05-21 14:17 by draco1987
[基金申请] 评审有感 +15 popular289 2026-05-18 26/1300 2026-05-21 10:35 by 西葫芦炒鸡蛋
[有机交流] 反应很差，大量原料没有反应 5+3 Mr.Zot 2026-05-19 8/400 2026-05-20 22:19 by Equinoxhua
[考博] 如果工作了想读博，可以边工作边读全日制嘛？ 30+3 铁达火车 2026-05-18 5/250 2026-05-20 09:33 by tfang
[考博] 博士申请 +5 星…… 2026-05-18 6/300 2026-05-18 23:49 by 糊糊涂涂好
[硕博家园] 我在等一个没有答案的答案 +3 Love_MH 2026-05-17 3/150 2026-05-18 02:22 by 竹林孤影
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭