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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 分类/鉴定 » 细菌16S测序 诡异的现象
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Leo要努力啊

金虫 (初入文坛)

[求助] 细菌16S测序 诡异的现象已有4人参与

最近在做一株红杆菌科细菌的鉴定工作,经过五六次平板纯化肉眼观测基本确定为纯菌,三次用细菌通用引物（27F、1492R）PCR扩增酚氯仿法提取的全基因组,电泳条带单一且很亮，长度1500bp左右。之后把PCR产物送去公司测序（前后送了两个不同的公司，应该不是公司测序的问题），27F测序结果很好（700bp左右）峰图单一且与最相似菌株相似度为100%，但1492R三次测序反馈结果都显示为杂合（峰图显示从开始出峰到最后结束全是套峰，且峰信号不强），不解这究竟是个什么原因？

自己猜测可能的原因有：
1.由于1492R引物正好在16S的V9高变区，我这株菌的16S正好又在这一区的序列跟别的菌不一样，导致了引物测序时与模板的结合问题。（想想也不对，如果是这样自己实验室PCR就用的1492R，又结合问题很难P出来才对，可我自己P的结果又很亮）
2.本身这株菌的基因组中有几个不同的16S拷贝，且在1492R所P的后半段的序列有差异，导致了后半段测序结果的杂合（自己又想想如果是种情况也不应该1492R的测序结果从出峰就杂合到一直结束吧，应该是中间的某一段出现这种杂合情况才对吧？）——现在自己觉得这种可能性最大。
3.细菌本身不纯，几种细菌相互污染（我觉得这种情况可能性最小，因为一：肉眼观测是一种纯菌，二：27F测序结果为单峰，如果是杂菌27F也应该杂合才对）

以上都是我的猜测，请各位大虾给点自己的意见吧！小弟在此谢过！

P.S.我现在要做的是不是做个大肠杆菌克隆然后再用载体上的序列设计引物来测序比较靠谱呢？但是这么做的前提是能确定菌体本身为纯菌，导致我出现问题的原因是这株菌基因组中有几个不同的16S拷贝；那如果细菌本身就不纯做克隆也不是解决的方法，所以我就捉急了，怎么确定到底是什么原因导致我出现这个问题呢，请各位给出出主意吧？
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1楼2014-04-26 15:59:10
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Leo要努力啊

金虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 肥猫p at 2014-04-26 19:50:16
我遇到和你相同的诡异事。我是把27F和1492R的目的条带连接在T载体上，挑的转化子拿去测序，不止一批转化子，不止一个测序公司，全说是双峰或者说双峰的概率在80%以上，后来我和测序公司的技术员沟通过，她说也不清楚 ...

你挑了克隆都出现这个问题就更加诡异了，我觉得可能就是对于咱俩的菌尤其是对于你已经做了克隆的可能性就更大了：某个引物1492R或者27F的引物，正好设计在了16S的高变区，对于咱俩比较特殊的菌株来说这个引物和模板有一定程度上的结合问题，自己PCR的时候影响不大也能P出来，但用这个引物测序就不行了。
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6楼2014-04-27 18:40:54
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Leo要努力啊

金虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by xiangchou812 at 2014-04-26 20:41:02
如果是这样是不是可以根据27F引物测出的序列设计步行引物进行测序？

正在考虑设计中间引物，可是如果模板还是用这个模板的话，用中间引物往后测，测到该出问题的地方还会出一样问题吧？
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7楼2014-04-27 18:42:24
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Leo要努力啊

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhsp07 at 2014-04-27 11:05:20
你这种问题，应该不是DNA模板的问题，因为你的27F测序图谱很好，第三种情况可以排除，至于第二种情况，这种概率很低。你说的第一种可能性还大一些。你看一下1492图谱，是否出现移码现象，一般引物合成是缺失或者多了 ...

非常感谢，1492R引物不是我提供的，是三个公司自己的，所以应该不是引物的问题，而且峰图显示是杂峰，不是单峰有移码这种情况。
您说的用反向互补758F测序是相当于用中间引物接着27F后面的测序吧？
有个疑问：为啥我说的第二种情况可能性很低，是不是因为27F结果很好，如果有几个16S之间又有差别话，出现差别的地方全在1492R一端的概率很低？但是如果真是第二种情况的话，是不是设计中间引物也不能解决问题呢，因为如果有几个16S，利用设计的中间引物测到了后面有差别的地方还是会有一样的杂合问题吧？
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8楼2014-04-27 18:53:34
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金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhsp07 at 2014-04-27 11:05:20
你这种问题，应该不是DNA模板的问题，因为你的27F测序图谱很好，第三种情况可以排除，至于第二种情况，这种概率很低。你说的第一种可能性还大一些。你看一下1492图谱，是否出现移码现象，一般引物合成是缺失或者多了 ...

另外还想请教您一下：如果是1492R端的模板有复杂结构，导致引物不好结合或者聚合酶易滑动，为什么自己在实验室做普通PCR时能出结果呢？是不是普通PCR的要求不高，这个复杂结果较容易突破，但是测序的话要求比较高呢？
若普通PCR要求也高有高级结构也不容易P出来的话，是不是可以认为这个菌本身有几个不同的16S拷贝这种情况的可能性比较大？
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9楼2014-04-27 18:59:53
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