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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 用16S测序鉴定单一菌株的困惑
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圣迭戈

铜虫 (小有名气)

[求助] 用16S测序鉴定单一菌株的困惑

从环境样品里面富集到的菌，用通用引物做了16S全长（1440bp）的PCR，然后做克隆文库以后送给公司测序，公司返回来的序列有20多条，都比较接近，但不是100%相同（看文献报道中似乎要求所有序列100%相同才能下所得到的菌为单株菌的结论）。不过我的序列两两之间相似度最低也有99.7%，即有1440多个碱基中有4个碱基突变。
有经验的高手帮看看这到底是因为富集体系中存在着多株菌？还是说是因为在实验过程中引入了突变？还是送给公司测序本来就存在误差？
注：因为本人富集的是一株自养菌，文献报道都是用液体培养基富集的，因此用平板划线法进行分离单株菌的方法不太可行。
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1楼 2013-07-21 23:38:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wangfei179

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先，通过液体培养基富集而不经单菌落划线，富集液中是不可能得到单菌的，因此PCR结果肯定是菌群16S；其次，PCR扩增时为减少误差最好用高保真酶。另外，文库建好后先做个酶切分型再测序。PS：自养菌平板培养要求不含有机质，琼脂应先用稀酸处理24小时。
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3楼2013-07-22 10:42:12
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普通回帖

wangfei179

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 发表的回复是乱码，可能是手机回复显示的问题吧，版主帮忙给你删除了啊 2013-07-23 17:06:30
zhang8826857: 编辑内容 2013-07-23 17:06
乱码，已编辑掉

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

[ Last edited by zhang8826857 on 2013-7-23 at 17:06 ]
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2楼2013-07-22 10:35:51
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圣迭戈

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangfei179 at 2013-07-22 10:42:12
首先，通过液体培养基富集而不经单菌落划线，富集液中是不可能得到单菌的，因此PCR结果肯定是菌群16S；其次，PCR扩增时为减少误差最好用高保真酶。另外，文库建好后先做个酶切分型再测序。PS：自养菌平板培养要求不 ...

谢谢，高保真酶有什么推荐的吗？
另外，我是PCR以后切胶回收，再连接到T-easy载体上，切胶这步会不会引入突变啊？我听说在紫外会有影响，但不知道是不是可信。
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4楼2013-07-22 14:30:41
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见神一笑

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangfei179 at 2013-07-22 10:42:12
首先，通过液体培养基富集而不经单菌落划线，富集液中是不可能得到单菌的，因此PCR结果肯定是菌群16S；其次，PCR扩增时为减少误差最好用高保真酶。另外，文库建好后先做个酶切分型再测序。PS：自养菌平板培养要求不 ...

自养菌划线是很难得到单菌落的，只能用液体富集筛选，或者涂布
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好好努力
5楼2013-07-24 09:21:22
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见神一笑

木虫 (著名写手)
你这个应该没什么问题，我觉得，序列同源性在99%以上一般都可以确定为同种了，当然你想要分株的话，最好还是用涂布试试
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好好努力
6楼2013-07-24 09:23:15
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大工小军

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
圣迭戈: 金币+10, ★有帮助 2013-12-15 16:22:04
我最近也要做自养菌的16sRNA,我是打算养完菌，把离完心的干菌，拿到宝生物那边给我测定，不知道结果如何呢？你那边最近有没有结果，希望多交流一下啊。。。
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加油
7楼2013-07-25 08:33:59
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圣迭戈

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 见神一笑 at 2013-07-24 09:23:15
你这个应该没什么问题，我觉得，序列同源性在99%以上一般都可以确定为同种了，当然你想要分株的话，最好还是用涂布试试

99%的确是同种，但是我看的这几篇文献里面都说序列是100%相同才确认是同一种菌，我现在就不知道到底是菌不纯还是说实验误差。
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8楼2013-07-29 13:38:42
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圣迭戈

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 大工小军 at 2013-07-25 08:33:59
我最近也要做自养菌的16sRNA,我是打算养完菌，把离完心的干菌，拿到宝生物那边给我测定，不知道结果如何呢？你那边最近有没有结果，希望多交流一下啊。。。

我最近外出没有在做，你是用离心完的干菌直接做生理生化测试吗?我做的只是菌种分析，P了16S以后测序。
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9楼2013-07-29 13:40:21
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hkqgeoffrey

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

16S方法中同源性>=97%,通过构建系统同源进化树位于同枝，数值 >73  ，采用NJ或ML两种以上方法进化树稳定就可以基本判定同种了，如果不放心可以再通过生理生化或其他方法辅助鉴定
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兴趣是第一导师，我爱它，因此我毫无疲倦的探索
10楼2013-07-30 12:55:42
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