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圣迭戈

铜虫 (小有名气)

[求助] 用16S测序鉴定单一菌株的困惑

从环境样品里面富集到的菌,用通用引物做了16S全长(1440bp)的PCR,然后做克隆文库以后送给公司测序,公司返回来的序列有20多条,都比较接近,但不是100%相同(看文献报道中似乎要求所有序列100%相同才能下所得到的菌为单株菌的结论)。不过我的序列两两之间相似度最低也有99.7%,即有1440多个碱基中有4个碱基突变。
有经验的高手帮看看这到底是因为富集体系中存在着多株菌?还是说是因为在实验过程中引入了突变?还是送给公司测序本来就存在误差?
注:因为本人富集的是一株自养菌,文献报道都是用液体培养基富集的,因此用平板划线法进行分离单株菌的方法不太可行。
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wangfei179

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先,通过液体培养基富集而不经单菌落划线,富集液中是不可能得到单菌的,因此PCR结果肯定是菌群16S;其次,PCR扩增时为减少误差最好用高保真酶。另外,文库建好后先做个酶切分型再测序。PS:自养菌平板培养要求不含有机质,琼脂应先用稀酸处理24小时。
3楼2013-07-22 10:42:12
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普通回帖

wangfei179

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 发表的回复是乱码,可能是手机回复显示的问题吧,版主帮忙给你删除了啊 2013-07-23 17:06:30
zhang8826857: 编辑内容 2013-07-23 17:06
乱码,已编辑掉

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

[ Last edited by zhang8826857 on 2013-7-23 at 17:06 ]
2楼2013-07-22 10:35:51
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圣迭戈

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wangfei179 at 2013-07-22 10:42:12
首先,通过液体培养基富集而不经单菌落划线,富集液中是不可能得到单菌的,因此PCR结果肯定是菌群16S;其次,PCR扩增时为减少误差最好用高保真酶。另外,文库建好后先做个酶切分型再测序。PS:自养菌平板培养要求不 ...

谢谢,高保真酶有什么推荐的吗?
另外,我是PCR以后切胶回收,再连接到T-easy载体上,切胶这步会不会引入突变啊?我听说在紫外会有影响,但不知道是不是可信。
4楼2013-07-22 14:30:41
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见神一笑

木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wangfei179 at 2013-07-22 10:42:12
首先,通过液体培养基富集而不经单菌落划线,富集液中是不可能得到单菌的,因此PCR结果肯定是菌群16S;其次,PCR扩增时为减少误差最好用高保真酶。另外,文库建好后先做个酶切分型再测序。PS:自养菌平板培养要求不 ...

自养菌划线是很难得到单菌落的,只能用液体富集筛选,或者涂布
好好努力
5楼2013-07-24 09:21:22
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见神一笑

木虫 (著名写手)

你这个应该没什么问题,我觉得,序列同源性在99%以上一般都可以确定为同种了,当然你想要分株的话,最好还是用涂布试试
好好努力
6楼2013-07-24 09:23:15
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大工小军

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
圣迭戈: 金币+10, 有帮助 2013-12-15 16:22:04
我最近也要做自养菌的16sRNA,我是打算养完菌,把离完心的干菌,拿到宝生物那边给我测定,不知道结果如何呢?你那边最近有没有结果,希望多交流一下啊。。。
加油
7楼2013-07-25 08:33:59
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圣迭戈

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 见神一笑 at 2013-07-24 09:23:15
你这个应该没什么问题,我觉得,序列同源性在99%以上一般都可以确定为同种了,当然你想要分株的话,最好还是用涂布试试

99%的确是同种,但是我看的这几篇文献里面都说序列是100%相同才确认是同一种菌,我现在就不知道到底是菌不纯还是说实验误差。
8楼2013-07-29 13:38:42
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圣迭戈

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 大工小军 at 2013-07-25 08:33:59
我最近也要做自养菌的16sRNA,我是打算养完菌,把离完心的干菌,拿到宝生物那边给我测定,不知道结果如何呢?你那边最近有没有结果,希望多交流一下啊。。。

我最近外出没有在做,你是用离心完的干菌直接做生理生化测试吗?我做的只是菌种分析,P了16S以后测序。
9楼2013-07-29 13:40:21
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hkqgeoffrey

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

16S方法中同源性>=97%,通过构建系统同源进化树位于同枝,数值 >73  ,采用NJ或ML两种以上方法进化树稳定就可以基本判定同种了,如果不放心可以再通过生理生化或其他方法辅助鉴定
兴趣是第一导师,我爱它,因此我毫无疲倦的探索
10楼2013-07-30 12:55:42
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