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细菌16S测序 诡异的现象已有4人参与
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最近在做一株红杆菌科细菌的鉴定工作,经过五六次平板纯化肉眼观测基本确定为纯菌,三次用细菌通用引物（27F、1492R）PCR扩增酚氯仿法提取的全基因组,电泳条带单一且很亮，长度1500bp左右。之后把PCR产物送去公司测序（前后送了两个不同的公司，应该不是公司测序的问题），27F测序结果很好（700bp左右）峰图单一且与最相似菌株相似度为100%，但1492R三次测序反馈结果都显示为杂合（峰图显示从开始出峰到最后结束全是套峰，且峰信号不强），不解这究竟是个什么原因？ 自己猜测可能的原因有： 1.由于1492R引物正好在16S的V9高变区，我这株菌的16S正好又在这一区的序列跟别的菌不一样，导致了引物测序时与模板的结合问题。（想想也不对，如果是这样自己实验室PCR就用的1492R，又结合问题很难P出来才对，可我自己P的结果又很亮） 2.本身这株菌的基因组中有几个不同的16S拷贝，且在1492R所P的后半段的序列有差异，导致了后半段测序结果的杂合（自己又想想如果是种情况也不应该1492R的测序结果从出峰就杂合到一直结束吧，应该是中间的某一段出现这种杂合情况才对吧？）——现在自己觉得这种可能性最大。 3.细菌本身不纯，几种细菌相互污染（我觉得这种情况可能性最小，因为一：肉眼观测是一种纯菌，二：27F测序结果为单峰，如果是杂菌27F也应该杂合才对） 以上都是我的猜测，请各位大虾给点自己的意见吧！小弟在此谢过！ P.S.我现在要做的是不是做个大肠杆菌克隆然后再用载体上的序列设计引物来测序比较靠谱呢？但是这么做的前提是能确定菌体本身为纯菌，导致我出现问题的原因是这株菌基因组中有几个不同的16S拷贝；那如果细菌本身就不纯做克隆也不是解决的方法，所以我就捉急了，怎么确定到底是什么原因导致我出现这个问题呢，请各位给出出主意吧？ |
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你这种问题，应该不是DNA模板的问题，因为你的27F测序图谱很好，第三种情况可以排除，至于第二种情况，这种概率很低。你说的第一种可能性还大一些。你看一下1492图谱，是否出现移码现象，一般引物合成是缺失或者多了碱基，图谱中能发现移码现象。如果确实是，重新合成1492引物测序就应该没问题了。（如果你三次测序用的1492R引物不是同一次合成的，这种可能性也不大） 如果不是1492R引物的问题，最有可能的问题是1492R端存在复杂结构，如ploy结构，会使得测序酶容易在模板上滑动，导致结构后的峰形变得杂乱，也可能是GC rich， 二级结构等。建议反向互补测序试试，如用758F测序（只要能跟27F测序有重合序列就行了，一般sanger测序法有效片段约800bp,所以不要太靠后），再跟27F测序结果拼接就OK了。 |
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