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仙境之桥2009

金虫 (初入文坛)

[求助] 重叠延伸PCR 已有3人参与

本人刚开始做重叠延伸PCR，现在在用重叠延伸PCR做点突变，之后要做表达用，两端有酶切位点。现在有一些问题，想请各位解答。我扩两条目的条带的时候，尝试了多个退火温度，但是条带都不单一，并且目的条带的量很少，请问如何才能使目的条带的单一且量增加啊？另外，进行融合的时候，我见贴子上说退火温度高一点，延伸时间长一点，进行5个循环，我想请教第一轮反应如何设置啊？是按正常的反应95℃ 5min，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，进行5个循环，再72℃ 10min，4℃ 10min，是这样么？退火温度怎么设置啊？第二轮反应，也是按上边的方法么？请各位前辈给于解答，非常感谢。
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1楼 2014-04-01 00:09:20
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mars199026

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-01 12:59:25
仙境之桥2009: 金币+2, ★有帮助 2014-04-01 18:01:05
目标条带不单一是否要注意下模板的问题，我做交叠PCR时候同常将模板稀释后按亮度比列进行融合！也有不加引物进行两轮PCR的方法！退火温度这个以前我也很纠结，现在一般都是55或58度直接跑没什么问题的，希望帮助你
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2楼2014-04-01 09:23:23
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-01 12:59:37
仙境之桥2009: 金币+2, ★有帮助 2014-04-01 18:01:39
为获得单一的条带你可以跑个梯度选选合适的退火温度，做重叠PCR时可以不用先做第一轮PCR，直接上循环。
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hehe
3楼2014-04-01 11:32:26
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bolysu

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
4楼2014-04-04 16:13:20
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