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仙境之桥2009

金虫 (初入文坛)

[求助] 重叠延伸PCR 已有3人参与

本人刚开始做重叠延伸PCR,现在在用重叠延伸PCR做点突变,之后要做表达用,两端有酶切位点。现在有一些问题,想请各位解答。我扩两条目的条带的时候,尝试了多个退火温度,但是条带都不单一,并且目的条带的量很少,请问如何才能使目的条带的单一且量增加啊?另外,进行融合的时候,我见贴子上说退火温度高一点,延伸时间长一点,进行5个循环,我想请教第一轮反应如何设置啊?是按正常的反应95℃ 5min,95℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1min,进行5个循环,再72℃ 10min,4℃ 10min,是这样么?退火温度怎么设置啊?第二轮反应,也是按上边的方法么?请各位前辈给于解答,非常感谢。
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bolysu

禁虫 (著名写手)

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4楼2014-04-04 16:13:20
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mars199026

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-04-01 12:59:25
仙境之桥2009: 金币+2, 有帮助 2014-04-01 18:01:05
目标条带不单一是否要注意下模板的问题,我做交叠PCR时候同常将模板稀释后按亮度比列进行融合!也有不加引物进行两轮PCR的方法!退火温度这个以前我也很纠结,现在一般都是55或58度直接跑没什么问题的,希望帮助你
2楼2014-04-01 09:23:23
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-04-01 12:59:37
仙境之桥2009: 金币+2, 有帮助 2014-04-01 18:01:39
为获得单一的条带你可以跑个梯度选选合适的退火温度,做重叠PCR时可以不用先做第一轮PCR,直接上循环。
hehe
3楼2014-04-01 11:32:26
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