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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于重叠PCR的问题~
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jnzhaoxy

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于重叠PCR的问题~

最近在做重叠PCR，要把一个基因的两个外显子连起来，选用的是Pfu扩增以获得这两个外显子片段，但是PCR结果是一点条带也没有，引物二聚体很亮，P了两次都这样；后来改用Ex Taq，其他都不变，PCR得到了很明显的目的条带，说明我的引物是没有问题的。请问我下一步应该怎么办呢？实验室有人建议我将以上片段回收，连T载后再用Pfu扩增，这种方法好不？再或者有没有更好的方法~菜鸟一枚，跪求指点！
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1楼 2013-06-27 14:30:50
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-10 18:45:32
Pfu具有高保真性，但是经常会扩不出来，不知道你的条带是多大，用一般的酶应该也是没有问题的。
你的目的就是获得这两个片段，建议还是往下进行吧，构建出来送公司测序就行。
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2楼2013-07-10 17:07:37
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-17 15:59:12
接楼上的回答补充一点, 普通Tag酶会在PCR产物两端3'处加A. 楼主如用Tag要注意这个多出的A和你要融合的片段是否兼容.
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3楼2013-07-10 17:14:30
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 很对！ 2013-07-17 15:58:45
做重叠延伸PCR连接外显子一定不能用普通Taq，因为会3'处加A，造成移码。可以用不同的Pfu扩增，也可以调整一下反应体系。
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4楼2013-07-17 13:39:21
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-17 15:59:00
Pfu酶的扩增效率蛮低的，如果片段比较大建议换其它的高保真酶。其次看你做融合片段目的是什么了，如果是定点突变做阳性对照的话Taq酶也没啥大问题。做表达的话就要注意突出的A碱基了。
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5楼2013-07-17 14:42:21
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jnzhaoxy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2013-07-10 17:07:37
Pfu具有高保真性，但是经常会扩不出来，不知道你的条带是多大，用一般的酶应该也是没有问题的。
你的目的就是获得这两个片段，建议还是往下进行吧，构建出来送公司测序就行。

片段大小一个1700bp，一条250bp，后改用Primer STAR，P出来了，谢谢
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6楼2013-09-20 21:53:39
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jnzhaoxy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wangweida2 at 2013-07-17 14:42:21
Pfu酶的扩增效率蛮低的，如果片段比较大建议换其它的高保真酶。其次看你做融合片段目的是什么了，如果是定点突变做阳性对照的话Taq酶也没啥大问题。做表达的话就要注意突出的A碱基了。

我融合片段是为了做表达，改用primer star，成功了
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7楼2013-09-20 21:56:15
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