应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于重叠PCR的问题~
71/1返回列表
查看: 2391  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

jnzhaoxy

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于重叠PCR的问题~

最近在做重叠PCR，要把一个基因的两个外显子连起来，选用的是Pfu扩增以获得这两个外显子片段，但是PCR结果是一点条带也没有，引物二聚体很亮，P了两次都这样；后来改用Ex Taq，其他都不变，PCR得到了很明显的目的条带，说明我的引物是没有问题的。请问我下一步应该怎么办呢？实验室有人建议我将以上片段回收，连T载后再用Pfu扩增，这种方法好不？再或者有没有更好的方法~菜鸟一枚，跪求指点！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-06-27 14:30:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-10 18:45:32
Pfu具有高保真性，但是经常会扩不出来，不知道你的条带是多大，用一般的酶应该也是没有问题的。
你的目的就是获得这两个片段，建议还是往下进行吧，构建出来送公司测序就行。
赞一下 回复此楼
2楼2013-07-10 17:07:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-17 15:59:12
接楼上的回答补充一点, 普通Tag酶会在PCR产物两端3'处加A. 楼主如用Tag要注意这个多出的A和你要融合的片段是否兼容.
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-10 17:14:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 很对！ 2013-07-17 15:58:45
做重叠延伸PCR连接外显子一定不能用普通Taq，因为会3'处加A，造成移码。可以用不同的Pfu扩增，也可以调整一下反应体系。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2013-07-17 13:39:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-17 15:59:00
Pfu酶的扩增效率蛮低的，如果片段比较大建议换其它的高保真酶。其次看你做融合片段目的是什么了，如果是定点突变做阳性对照的话Taq酶也没啥大问题。做表达的话就要注意突出的A碱基了。
赞一下 回复此楼
5楼2013-07-17 14:42:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jnzhaoxy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2013-07-10 17:07:37
Pfu具有高保真性，但是经常会扩不出来，不知道你的条带是多大，用一般的酶应该也是没有问题的。
你的目的就是获得这两个片段，建议还是往下进行吧，构建出来送公司测序就行。

片段大小一个1700bp，一条250bp，后改用Primer STAR，P出来了，谢谢
赞一下 回复此楼
6楼2013-09-20 21:53:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jnzhaoxy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wangweida2 at 2013-07-17 14:42:21
Pfu酶的扩增效率蛮低的，如果片段比较大建议换其它的高保真酶。其次看你做融合片段目的是什么了，如果是定点突变做阳性对照的话Taq酶也没啥大问题。做表达的话就要注意突出的A碱基了。

我融合片段是为了做表达，改用primer star，成功了
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2013-09-20 21:56:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jnzhaoxy 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 考博求助 10+3 社会实践对别 2026-11-08 3/150 2026-11-13 14:04 by 沐小虫252
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 gRND4NVAZ8VG 2026-11-11 5/250 2026-11-13 11:15 by Equinoxhua
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +8 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 9/450 2026-11-13 11:11 by Equinoxhua
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +5 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 9/450 2026-11-13 11:02 by Equinoxhua
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +6 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 7/350 2026-11-13 10:55 by Equinoxhua
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +6 czAiolzR0IJC 2026-11-10 6/300 2026-11-12 16:55 by zzy933268
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 TgvkbZZl9tqB 2026-11-11 4/200 2026-11-12 12:28 by ECLTXnJnRSXf
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 Z7qfCsdIiD1T 2026-11-10 9/450 2026-11-12 11:22 by HajghKOMynmz
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 czAiolzR0IJC 2026-11-10 8/400 2026-11-12 11:00 by HajghKOMynmz
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 8/400 2026-11-12 10:27 by HajghKOMynmz
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +8 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 12/600 2026-11-12 09:32 by HajghKOMynmz
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +7 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 9/450 2026-11-12 09:24 by HajghKOMynmz
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 TgvkbZZl9tqB 2026-11-11 4/200 2026-11-12 08:15 by HajghKOMynmz
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 czAiolzR0IJC 2026-11-10 5/250 2026-11-12 06:36 by 9fOTqj074tIg
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 C6CRn66RYYXS 2026-11-10 6/300 2026-11-12 06:03 by 9fOTqj074tIg
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 YHiw1gou1Eda 2026-11-10 6/300 2026-11-12 05:41 by 9fOTqj074tIg
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 YHiw1gou1Eda 2026-11-10 7/350 2026-11-12 05:39 by 9fOTqj074tIg
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 8/400 2026-11-12 05:30 by 9fOTqj074tIg
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 7/350 2026-11-12 05:19 by 9fOTqj074tIg
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +6 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 9/450 2026-11-12 04:57 by 9fOTqj074tIg
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭