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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠延伸PCR第一轮做出来了，但是第二轮P不出来
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[交流] 重叠延伸PCR第一轮做出来了，但是第二轮P不出来

我现在要做重叠延伸，第一轮PCR的两个片段都P出来了，核酸电泳的位置也是正确的，但是第二轮PCR总是P不出来，跑电泳时在100bp及250bp左右有很亮的条带，但是我的目的片段是在1400bp左右！哪位大侠知道这是什么原因啊？！
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1楼 2012-07-20 13:03:48
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回帖置顶 ( 共有13个 )

mitocam

新虫 (正式写手)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
100bp和250bp的是什么？
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3楼2012-07-21 06:44:45
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mitocam at 2012-07-21 06:44:45
100bp和250bp的是什么？

不知道啊，可能是引物二聚体吧，我们也很纠结那两条带是什么东西
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4楼2012-07-21 09:16:36
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beer胖

新虫 (小有名气)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
第一轮两个片段的大小分别多少？
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5楼2012-07-21 09:58:34
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by beer胖 at 2012-07-21 09:58:34
第一轮两个片段的大小分别多少？

A片段670bp    B片段710bp
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6楼2012-07-21 11:08:14
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
模板克可以多加些，确保两个片段等摩尔，各加入约50ug，
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7楼2012-07-21 13:25:57
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莹莹陀zws

金虫 (正式写手)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
我现在也遇到类似的问题，纠结
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9楼2012-07-21 19:37:57
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sd3824289

木虫 (正式写手)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
建议楼主，在做第二轮的时候做个温度梯度，估计是退火温度的问题！我也遇到过这样的问题！
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11楼2012-07-22 10:00:12
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beer胖

新虫 (小有名气)
第一轮p出来以后回收的片段，不要用试剂盒里面的TE缓冲液洗脱，直接用无菌水洗。
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12楼2012-07-22 10:21:47
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by beer胖 at 2012-07-22 10:21:47
第一轮p出来以后回收的片段，不要用试剂盒里面的TE缓冲液洗脱，直接用无菌水洗。

这有影响吗？我们一直都是用试剂盒里的Elution buffer洗脱，没出现过这种情况，这是第一次，不知道什么原因啊
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14楼2012-07-22 13:53:18
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beer胖

新虫 (小有名气)
我用水洗的，都可以p第二轮的
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15楼2012-07-22 23:30:56
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hzlatqh

银虫 (小有名气)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
15楼: Originally posted by beer胖 at 2012-07-22 23:30:56
我用水洗的，都可以p第二轮的

也遇到过类似的情况，期待lz尝试用无菌水洗脱的结果出来。。。
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16楼2012-07-23 00:05:24
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jiangyhai

金虫 (著名写手)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
第二轮的时候先把两个片段混合延伸几个循环再加入引物试试看看。
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17楼2012-07-23 08:20:12
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jidixueli

新虫 (初入文坛)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
你第二轮的两条引物的退火温度差多少啊？ 我之前是因为后一轮的退火温度差比较多 所以p不出来的
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18楼2012-07-23 10:00:13
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liygmail at 2012-07-21 13:25:57
模板克可以多加些，确保两个片段等摩尔，各加入约50ug，

试过了，P不出来
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8楼2012-07-21 15:38:47
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
上图看看才好分析
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10楼2012-07-21 22:09:51
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-22 10:00:12
建议楼主，在做第二轮的时候做个温度梯度，估计是退火温度的问题！我也遇到过这样的问题！

已经试过了，没有效果
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13楼2012-07-22 13:51:20
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jidixueli

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也试过梯度温度 也没p出来 估计还是得重新设计引物的吧 不过后来我没有继续了
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19楼2012-07-23 10:04:10
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by jidixueli at 2012-07-23 10:00:13
你第二轮的两条引物的退火温度差多少啊？ 我之前是因为后一轮的退火温度差比较多 所以p不出来的

差了2°，应该没啥影响吧！！
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20楼2012-07-23 10:09:35
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by jidixueli at 2012-07-23 10:04:10
我也试过梯度温度 也没p出来 估计还是得重新设计引物的吧 不过后来我没有继续了

引物有重新设计过，也是P不出来
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21楼2012-07-23 10:09:55
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by jiangyhai at 2012-07-23 08:20:12
第二轮的时候先把两个片段混合延伸几个循环再加入引物试试看看。

这种方法真的会有效吗？！我们已经尝试了好多方法依然都P不出来！！只是有一次，紫外下看的时候在1000bp左右有暗黄色的东西，不知道那会是什么啊？！
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22楼2012-07-23 10:11:36
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by beer胖 at 2012-07-22 23:30:56
我用水洗的，都可以p第二轮的

嗯，可以试试
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23楼2012-07-23 10:14:33
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smdsfy

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
看一下你得到的两个片段的亮度，调整它们之间的比例，另外，你还有看引物与使用的模板的摩尔比，调整一下，，你说有引物二聚体的话，引物应该没有问题，把片段A与B的比例调整一下，祝你成功！
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24楼2012-07-23 15:34:44
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jl860822

金虫 (正式写手)
建议把第1轮扩出来的100和250bp的片段测序一下，看看到底是什么东西
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25楼2012-07-23 19:58:19
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jidixueli

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
20楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2012-07-23 10:09:35
差了2°，应该没啥影响吧！！...

那应该还好的啊 那我的经验就真的对你没用了   你先p几个循环再加引物啊？
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26楼2012-07-24 17:56:31
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
26楼: Originally posted by jidixueli at 2012-07-24 17:56:31
那应该还好的啊 那我的经验就真的对你没用了   你先p几个循环再加引物啊？...

那这样的话，应该要怎么样设置PCR程序呢？！
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27楼2012-07-24 19:28:27
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smartest183

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
第二轮时两个片段比例做个梯度吧，你是出现smear还是什么都没有呢？出现smear的话你taq酶和引物的量都要降低一些，什么都没有的话两者稍微多一点。另外你用的Taq酶是什么酶？有的片段pfu可能p不出来，换个保真性不那么好的先试试。LA Taq有可能效果好些。
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28楼2012-09-04 11:29:30
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chjinzhi

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-19 14:56:37
会不会是你酶的问题。你第一轮用的是什么没？建议用不会添加PolyA的酶试试。我用的是高保真的酶，结束后是平滑末端。再者你第二轮的退火温度可以加长一些。我是做了这些改变才做出来的。
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29楼2012-09-19 11:27:10
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duyao12312

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问lz  最后是怎么解决的 我最近也遇到同样的情况，求解答
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30楼2015-08-12 19:11:00
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xgj2008best2楼
2012-07-20 13:39   回复  
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