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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠延伸PCR第一轮做出来了，但是第二轮P不出来
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[交流] 重叠延伸PCR第一轮做出来了，但是第二轮P不出来

我现在要做重叠延伸，第一轮PCR的两个片段都P出来了，核酸电泳的位置也是正确的，但是第二轮PCR总是P不出来，跑电泳时在100bp及250bp左右有很亮的条带，但是我的目的片段是在1400bp左右！哪位大侠知道这是什么原因啊？！
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1楼 2012-07-20 13:03:48
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by mitocam at 2012-07-21 06:44:45
100bp和250bp的是什么？

不知道啊，可能是引物二聚体吧，我们也很纠结那两条带是什么东西
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4楼2012-07-21 09:16:36
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by beer胖 at 2012-07-21 09:58:34
第一轮两个片段的大小分别多少？

A片段670bp    B片段710bp
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6楼2012-07-21 11:08:14
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by liygmail at 2012-07-21 13:25:57
模板克可以多加些，确保两个片段等摩尔，各加入约50ug，

试过了，P不出来
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8楼2012-07-21 15:38:47
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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11楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-22 10:00:12
建议楼主，在做第二轮的时候做个温度梯度，估计是退火温度的问题！我也遇到过这样的问题！

已经试过了，没有效果
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13楼2012-07-22 13:51:20
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by beer胖 at 2012-07-22 10:21:47
第一轮p出来以后回收的片段，不要用试剂盒里面的TE缓冲液洗脱，直接用无菌水洗。

这有影响吗？我们一直都是用试剂盒里的Elution buffer洗脱，没出现过这种情况，这是第一次，不知道什么原因啊
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14楼2012-07-22 13:53:18
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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18楼: Originally posted by jidixueli at 2012-07-23 10:00:13
你第二轮的两条引物的退火温度差多少啊？ 我之前是因为后一轮的退火温度差比较多 所以p不出来的

差了2°，应该没啥影响吧！！
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20楼2012-07-23 10:09:35
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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19楼: Originally posted by jidixueli at 2012-07-23 10:04:10
我也试过梯度温度 也没p出来 估计还是得重新设计引物的吧 不过后来我没有继续了

引物有重新设计过，也是P不出来
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21楼2012-07-23 10:09:55
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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17楼: Originally posted by jiangyhai at 2012-07-23 08:20:12
第二轮的时候先把两个片段混合延伸几个循环再加入引物试试看看。

这种方法真的会有效吗？！我们已经尝试了好多方法依然都P不出来！！只是有一次，紫外下看的时候在1000bp左右有暗黄色的东西，不知道那会是什么啊？！
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22楼2012-07-23 10:11:36
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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15楼: Originally posted by beer胖 at 2012-07-22 23:30:56
我用水洗的，都可以p第二轮的

嗯，可以试试
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23楼2012-07-23 10:14:33
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
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26楼: Originally posted by jidixueli at 2012-07-24 17:56:31
那应该还好的啊 那我的经验就真的对你没用了   你先p几个循环再加引物啊？...

那这样的话，应该要怎么样设置PCR程序呢？！
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27楼2012-07-24 19:28:27
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